Western-Blot详解及问题分析讲课稿.pptVIP

Staking gel Separating gel 注意事项： 1.抗原样品与缓冲液混合水浴加热时不要进水！最好采用空气浴； 2.电泳Buffer最好不要重复利用，因为样品比较珍贵，而电泳液相对廉价； 3.Buffer一定要漫过梳子孔，否则就会发现蛋白跑不动； 4.电泳时先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白。 2.转膜 要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。 常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。 转移膜的选择 最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。 各种膜的详细特点介绍： /bio101/2008/21461_2.htm 转印膜比较 膜的选择主要根据： a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）； b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）； c.如果后继实验有