叶绿素分离,提取与含量测定.docVIP

基础生物学技术实验 141140003曹志凡 B3常帅，乐子薇，杜天明2014.12.3 叶绿素提取、分离与测定 曹志凡141140003 实验目的 了解叶绿体色素的构成； 了解叶绿素的某些物理及化学性质，掌握提取叶绿素及分离叶绿素的原理； 了解纸层析法分离色素的实验原理 4、学会用纸层析的方法分离叶绿体色素； 5、初步学习用分光光度计测定叶绿素ab含量。 实验原理 植物叶绿体色素是吸收太阳光能,进行光合作用的重要物质.它一般由叶绿素a,叶绿素b,胡萝卜素和叶黄素组成，它们与类囊体膜上的蛋白质相结合，而成为色素蛋白复合体。 绿色素（包括叶绿素a蓝绿色和叶绿素b黄绿色）和黄色素（包括胡萝卜素黄色和叶黄素橙黄色）这两类色素都很难溶于水，而易溶于有机溶剂,故可用乙醇,丙酮等有机溶剂提取。 由于光合色素位于叶绿体中的类囊体上，要把它提取出来必须破坏叶表皮、细胞壁和细胞膜、叶绿体的双层膜，所以要剪碎后加二氧化硅研磨，以便充分提取色素。 叶绿素是一种含镁的化合物，其中的镁易被H+、Cu2+、Zn2+等取代。当被H+取代后，就形成去镁叶绿素，呈黄褐色。虽然研磨过程中不发生产生大量H+的化学反应，但 \t /q/_blank 液泡中常含有多种有机酸。一般认为，碳酸钙的作用在于中和研磨过程中产生的H+，以防止叶绿素被破坏。 纸层析法又称纸色谱法。以纸为载体的色谱法，固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如 \t /doc/_blank 缓冲液， \t /doc/_blank 甲酰胺等。根据不同色素在层析液中的溶解度不同造成随层析液扩散速度不同这一原理进行分离。 当层析溶剂不断从纸上流过时,由于混合物(叶绿素提取液)中各种成分在固定相和流动相间溶解度和吸附能力不同而具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后,可将各种色素分开，其中胡萝卜素在层析液中的溶解度最高，扩散速度最快，其次是叶黄素、叶绿素a，叶绿素b溶解度最低，扩散得最慢。 分光光度计就是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器 ， 分光光度法则是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析 分光光度计采用一个可以产生多个 \t /doc/_blank 波长的 \t /doc/_blank 光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度，样品的吸光值与样品的浓度成正比。 叶绿体色素及胡萝卜素都有一定的光学活性，表现出一定的吸收光谱，可以用分光光度计精确测定。 叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b在645nm，吸收曲线彼此又有重叠，根据Lambert—Beer定律，如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽有明显的差异，但吸收曲线彼此又有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对吸光度的影响，最后分别得到两种组分的含量。 根据Lambert—Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与吸光度A之间有如下的关系 (1)A1=Ca·ka1+Cb·kb1 (2)A2=Ca·ka2+Cb·kb2 （Ca为组分a的浓度，g/L，Cb为组分b的浓度，g/L，A1为在波长λ1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的吸光度A值。A2为在波长λ2（即组分b的最大吸收峰波长）时，混合液的吸光度A值，ka1为组分a的比吸收系数，即组分a当浓度为1g/L时，于波长λ1时的吸光度A值，kb2为组分b的比吸收系数，即组分b当浓度为1g/L时，于波长λ2时的吸光度A值，ka2为组分a（浓度为1g/L）在波长λ2时的吸光度A值，kb1为组分b（浓度为1g/L）在波长λ1时的吸光度A值） 实验的试剂与器材 1.实验材料：菠菜或青菜叶片。 2.实验试剂：无水乙醇或丙酮，石英砂，碳酸钙粉，层析液: 石油醚10ml+丙酮2ml+苯1ml（有毒）。 3.实验器材：研钵，漏斗，小烧杯，剪刀，滴管, 滤纸，脱脂棉，毛细管，吸水纸。 实验步骤 1.叶绿体色素的提取 （1）取植物新鲜叶片2 g,洗净,擦干,去掉粗的叶脉，剪碎,放入研钵中； （2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉, 研磨至近乎糊状，加入10-15mL 无水乙醇,再研磨片刻，提取3-5 min，然后用漏斗（内放一层薄的脱脂棉）过滤,即得色素提取液。 2.叶绿体色素的分离 （1）制备滤纸条：剪去一端两角，在距离剪角一端1～ 1.5 cm处用铅笔画线（或简单做个记号）。 （2） 画滤液细线：用毛细吸管吸收少量滤液，沿铅笔线（记号）处均匀地画一条直的滤液细线。干燥后，连续重复3～5次，至滤液细线