微生物学类实验指导书(下)蛋白酶产生菌活力测定及果酒酵母分离纯化.pdfVIP

实验一 产酶微生物的分离、纯化与选育 酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有 2500 多种。由于酶促反应的 特异性强，反应条件温和，安全无毒，环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域 具有广泛的应用价值。目前，能由工业生产的 50 多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、 纤维素酶、葡萄糖氧化酶，葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的。 通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技 术。 2. 蛋白酶产生菌的分离与纯化 2.1 实验目的 学习从自然界中分离蛋白酶产生菌并纯化。 2.2 实验原理 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤 样品 （或其他样品）悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其 接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平 板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。 2.3 实验仪器与材料 土壤样品或其他富含蛋白质的样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无 菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无 菌试管、量筒等。 2.4 实验方法与步骤 2.4.1 分离 1）采集土壤样品，用无菌水制备 1：10 土壤悬液； 2 ）取 1：10 土壤悬液 5ml，注入已灭过菌的试管 ，将此试管放入 75-80 ℃水浴中热处理 10 min ， 以杀死非芽孢细菌； 3 ）取加热处理过的土壤悬液 100-200 μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置，于 30-32 ℃培养 24-48 h ； 4 ）对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢 染色，判断是否为芽孢杆菌。 2.4.2 筛选 1）从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种含酪蛋白的斜面培养基，再点 接于含酪蛋白的平板，30-32 ℃培养 24-48 h ，测定平板上菌苔直径和水解圈直径。2 ）水解圈直径与菌 落直径比值大的那个菌株对应的斜面培养物，可作为进行诱变选育或酶发酵、酶活力测定菌株。 2.5 实验结果 在含酪蛋白的平板上，产蛋白酶的芽孢杆菌可形成蛋白质水解圈。自然界中分离的微生物各菌株间 产蛋白酶活力有很大差异，有些芽孢杆菌酶活力超过 4000 U/mL 。 1）描述你所分离的蛋白酶产生菌的菌落特征和个体形态特征；2 ）报告你所分离的蛋白酶产生菌的 1 初筛（水解圈与菌苔直径的比值）结果。 2.6 注意事项 1）土壤悬液加热处理的温度和时间应准确控制；2 ）点接含酪蛋白的平板时，接种量及 接种面积要基本相同。 2.7 分析与讨论 在酪蛋白平板上水解圈与菌落直径比值大的菌落，其蛋白酶活力不一定大，因此，对 初筛选出的水解圈与菌落直径比值大的菌落要进行发酵培养，进一步对发酵液进行酶活力测定。 2.8 思考题 1）对所筛选的菌株如何进一步提高酶活力？请写出设想和方案；2 ）蛋白酶有哪些方面的 应用。 参考书目 [1] 扬文博，微生物学实验.北京:化学工业出版社，2004. [2]黄秀梨、辛明秀主编，微生物学实验指导，高等教育出版社，2008 年. 附：相关培养基 1．酪素培养基：牛肉膏 0.3g、NaCl 0.5g ，酪素 1.0g，琼脂 2.0g ，水 100mL， pH 7.6-8.0 。配制方法： 称取酪素 1g，先用少量 2%NaOH 润湿，玻璃棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至 完全溶解，补足水量至 100mL，加入其他成分，调整 pH 值，灭菌备用。 2 ．产蛋白酶发酵培养基：玉米粉 6.0g，豆饼粉 4.0g ，Na HPO 0.4g ，KH PO 0.03g ，Na CO 0.1g ，自 2 4 2 4 2 3 来水 100 mL ，pH 9.0(灭菌前) 。配制方法：称取玉米粉 3g、豆饼粉 2g ，置于洁净干燥的 500mL 锥形瓶 中，轻轻摇动，使物料混匀。按上述配方用自来水配置无机盐溶液 50mL，调 pH 值，倒入装有物料的 锥形瓶中，混匀，0.1MPa 压力，