碱性磷酸酶米氏常数的测定.pptxVIP

一、目的要求1.学习分光光度法测定的原理和方法2.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定的原理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基酚磷酸为底物时的Km 和Vm值。二、原理一、分光光度法的基本原理及方法（一）利用吸收光谱对物质进行定性分析1．原理（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析 1．原理 Beer-Lambert（比尔）定律： T=I/I0 A=lg1/T=lgI0/I A=KCL其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度；K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度 2．常用方法 （1）标准曲线法 OD或Ａ　浓度标准曲线与样品的测定条件必须一致。（2）标准管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可求得CX。 （3）摩尔吸光系数法 C=A/?（?为L=1cm，C为1mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。(二)米氏常数的测定原理酶促反应v-[S]曲线 v [S]推导出米氏方程为：其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km 为米氏常数 米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。 测定Km和Vm，可通过作图法求得。 最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化