SZDB∕Z 313-2018 H5N6 亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测.docxVIP

ICS 11.220 B 41 SZDB/Z 深 圳 市 标 准 化 指 导 性 技 术 文 件 SZDB/Z 313—2018 H5N6 亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR 检测方法 Method of the real-time RT-PCR for detection of subtype H5N6 avian influenza virus 2018-07- 04 发布 2018-08-01 实施 深圳市市场监督管理局 发 布 SZDB/Z 313 SZDB/Z 313—2018 SZDB/Z 313 SZDB/Z 313—2018 I I 目 次 前言 II 范围 1 规范性引用文件 1 术语和定义 1 原理 1 仪器与试剂 1 生物安全要求 2 样品采集和前处理 2 核酸提取 3 核酸提取 4 分析条件设定 4 结果判定 4 附录 A （规范性附录） 试常用剂配制 6 附录 B （资料性附录） 实时荧光 RT-PCR 反应体系配制 7 附录 C （资料性附录） H5N6 亚型禽流感病毒实时荧光 RT-PCR 典型扩增曲线图例 8 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本文件的附录A为规范性附录，附录B和附录C为资料性附录。本文件由深圳市检验检疫科学研究院提出。 本文件由中华人民共和国深圳出入境检验检疫局归口。 本文件起草单位： 本文件起草人： II SZDB/Z 313 SZDB/Z 313—2018 SZDB/Z 313 SZDB/Z 313—2018 PAGE PAGE 2 PAGE PAGE 1 H5N6 亚型禽流感病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法 范围 本文件规定了H5N6亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR的检测方法。 本文件适用于快速检测禽类咽拭子、鼻拭子、泄殖腔拭子、组织样品等临床样品中H5N6亚型流感病毒。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 GB/T 18936 高致病性禽流感诊断技术 GB 19442 高致病性禽流感防治技术规范 GB 19489 实验室生物安全通用要求 缩略语 CT值 CYCLE THRESHOLD，反应管的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数DEPC DIETHYLPROCARBONATE，焦碳酸二乙酯 FAM 6-CARBOXY-FLUORESCEIN，6-羧基荧光素 RT-PCR REVERSE TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION,反转录聚合酶链式反应 原理 采用TaqMan方法，分别选择H5N6毒株序列相对最保守的HA基因和NA基因作为H5N6检测的靶序列。采用DNAMAN软件对Genbank公布的所有序列进行Blast比较后，分别在各自的高度保守序列内进行引物和探针的设计。该探针的结合部位位于目的扩增片段内部。其中HA基因探针5’端标记FAM荧光素为报告荧光基团，NA基因探针5’端标记HEX荧光，3’端均标记BHQ为淬灭荧光基团。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上荧光基团发出的荧光信号被淬灭基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶发挥5’→3’的外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的荧光基团游离出来，所发出的荧光不再为淬灭基团所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 仪器与试剂 仪器 实时荧光PCR仪、高速冷冻离心机（最大转速15 000 r/min ）、生物安全柜、混匀器、冰箱（2℃～ 8℃，-20℃，-80℃）、微量可调移液器（10 μL, 100 μL, 1000 μL）、带滤芯吸嘴（10 μL, 100 μ L, 1000 μL）、灭菌研钵、离心管、PCR光学反应管。 试剂 试剂级别 除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T 6682规定的一级水，所用化学试剂均为分析纯。 引物与探针 用 HA 基因引物探针 HA Pb：5’FAM-TCW ACA GTG GCG AGT TCC CTA GCA-BHQ1-3’ HA FP：5’ACR TAT GAC TAY CCA CAR TAY TCA G3’ HA RP：5’AGA CCA GCT AYC ATG ATT GC3’ NA 基因引物探针 NA Pb：5’HEX-CCAATAACAGGAGGGAGCCCAGACCC-BHQ1-3’ NA FP