土壤脲酶活性的测定.docVIP

10 靛酚蓝比色法测定土壤脲酶的活性 一、实验原理 靛酚蓝比色法的基本原理是：被测物浸提剂中的NH4+，在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚反应，生成水溶性染料靛酚蓝，其深浅与溶液中的NH4+－N含量呈正比，线性范围为0.05~0.5mg/l之间。 靛酚蓝反应原理如下: NH3 + OCl——NH2 Cl +OH- 三、实验试剂 1） 10%尿素：称取10g尿素，用蒸馏水溶至100ml。 2） 柠檬酸盐缓冲液（PH=6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。 3） 苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量无水乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用无水乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。 4） 次氯酸钠溶液：用水稀释试剂至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。（9ml—100ml中） 5） 氮的标准溶液（0.1mg/ml）：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液。 6）甲苯 四、实验过程 1.标准曲线的测定 吸取10ml氮的标准溶液定容至100ml，摇匀。从其中分别吸取0，1.00，3.00，5.00，7.00，10.00ml 13.00ml移至50ml比色管中，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠的溶液，充分混合。紧接着加入3ml次氯酸钠，随加随摇匀，放置20分钟,用水稀释至刻度。将显色液在可见分光光度计上于578nm处，以1cm比色皿进行比色测定，以试剂空白为参比。以标准溶液氮含量为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。 2.土样中脲酶活性的测定 分别称取2g过1mm筛的风干土样于50ml锥形瓶中，向其中加入1ml甲苯，以使土样全部湿润为宜。放置15分钟后，加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（pH=6.7），并摇匀。将锥形瓶放入37℃恒温箱中，培养24h。培养结束后，用热至38℃水稀释至刻度，充分摇荡，并将悬液用滤纸过滤到锥形瓶 设置有土无基质对照，即考察各种溶液和土壤中氨氮存在带来的影响。相当于其他实验中所做的空白对照。 分别吸取（1-3ml）滤液于50ml容量瓶中，加蒸馏水至20ml，充分震荡，然后加入4ml苯酚钠，充分混合，再加入3ml次氯酸钠充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度，溶液呈现靛酚的蓝色（在1h内保持稳定）。在分光光度计上用1cm比色杯，于578nm处进行比色测定。 无土对照：不加土样，其他与实验同，以检验试剂忖度，整个实验设1个 无基质对照：以等提及水代替基质，其他与实验相同。 土壤脲酶活性以24小时1g土壤中NH3－N的毫克数表示。 注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解。 3、如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样 四、结果计算： 以24小时后1g土壤中NH3－N的毫克数表示土壤脲酶活性（Ure）。 Ure=（a样品－a无土－a无基质）×V×n／m 式中：a样品为样品吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数； a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数； a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数； V为显色液体积；n为分取倍数，浸出液体积／吸取滤液体积；m表示烘干土重