流感亚单位疫苗的制备流程.docVIP

流感亚单位疫苗的制备流程 摘要：流感疫苗用于预防流行性感冒。目前，世界上公认的最成熟、最安全的生产方法：鸡胚培养法。传统的鸡胚流感疫苗生产大致分为6个步骤，包括病毒培养、收获、纯化、裂解、灭活和终过滤，成为单价流感疫苗原液，这些步骤因不同厂家的工艺不同可有所不同。本文就流感疫苗进行大胆设计，采用亚单位疫苗的生产工艺流程来设计流感疫苗的生产制备流程。此类疫苗具有很好的安全性。 关键词：流感疫苗；亚单位疫苗；制备过程 流感疫苗用于预防流行性感冒。适用于任何可能感染流感病毒的健康人，每年在流行季节前接种一次，免疫力可持续一年。流感疫苗是预防和控制流感的主要措施之一。可以减少接种者感染流感的机会或者减轻流感症状。我国目前使用三种 流感疫苗：全病毒 灭活疫苗、裂解疫苗和 亚单位疫苗。每种疫苗均含有甲1亚型、甲3亚型和乙型3种流感灭活病毒或抗原组份。这三种疫苗各有特点：全病毒 灭活疫苗免疫原性不错但副作用较大； 亚单位疫苗副作用较小但免疫原性一般；裂解疫苗免疫原性和副作用比较理想，也是目前世界及中国使用最为普遍的 流感疫苗。裂解疫苗常用鸡胚作为病毒生长介质作为培养基质来生产流感疫苗。它首先将不同型别的流感病毒毒株分别接种于鸡胚,经培养后,收获其尿囊液,制备主代和工作种子批。将工作种子批接种来源于封闭式房舍内饲养的健康鸡群鸡胚进行大规模培养,收获病毒液,然后经超滤浓缩、纯化、裂解、灭活、二次纯化等步骤,获得三个型别的单价病毒液。本文，主要从亚单位疫苗方面着手设计流感病毒的制备原理和制备过程。 一、流感亚单位疫苗制备的原理 通过 化学分解或有控制性的蛋白质水解方法，提取细菌、病毒的特殊 蛋白质结构，筛选出的具有 免疫活性的片段制成的疫苗，称为亚单位疫苗。流感疫苗亚单位疫苗通过选择合适的裂解剂和裂解条件，将流感病毒膜蛋白HA和NA裂解下来，选用适当的纯化方法得到纯化的HA和NA蛋白。纯化的HA和NA蛋白就是流感疫苗亚单位疫苗。 二、流感亚单位疫苗制备的过程 （一）流感病毒种子批的制备 （1）流感病毒主代种子批的建立：选取鸡胚注入原始流感病毒株。 （2）流感病毒工作种子批的建立：从主种子批中选择血凝效价高的毒种作为工作种子批的建立毒种。 （3）病毒种子批的检定：鉴别试验,病毒血凝效价,病毒感染性滴度等。 （二）流感病毒的培养和收获 分别取各型的工作种子批中的一支,按照前摸索的各型别最佳稀释度进行稀释,接种于11日龄的封闭式房舍内饲养的健康鸡群鸡胚经33℃培养一定时间后,放入4℃冷胚过夜,次日分型分批收获其尿囊液,在收获鸡胚尿囊液时,溶血、尿酸盐沉淀、死胚等情况的尿囊液应注意不被收入。分别对不同型别、不同批次的尿囊液进行检测,纪录血凝效价,将总收获的各单型澄清鸡胚尿囊液进行超滤浓缩。 （三）流感病毒液澄清和超滤浓缩 将各批单型别的病毒原液分别用盖有120目滤网合并过滤,将无菌试验和灭活试验合格的尿囊液进行澄清过滤,即经1um滤膜粗滤后,再经两次0.45um滤膜过滤,最后用相对分子质量1000K的膜包进行超滤浓缩,用0.01的PBS作最后浓缩,浓缩液中再加入0.25mol/LPB回收病毒液。 （四）流感病毒液区带离心纯化 用不同蔗糖浓度作为蔗糖密度梯度,以25000rpm的离心速度离心3h。 （五)流感病毒液的裂解 选择合适的裂解剂和裂解条件，将流感病毒膜蛋白HA和NA裂解下来。 （六）流感病毒液的灭活 （1）单价裂解病毒液的灭活摸索。 （2）灭活效果试验。 （3）抗原免疫效果实验 以血凝抑制试验测定抗体效价。 （4）灭活病毒基因完整性检测 （5）单向免疫扩散法检测血凝素含量。 （七） 裂解灭活病毒液二次区带离心纯化 将裂解灭活后的单型病毒原液超滤,去除蔗糖和大部分裂解灭活剂，进行蔗糖密度梯度离心来纯化并收集各区段病毒液。 （八）流感纯化液的除菌过滤 将通过蔗糖密度梯度离心收集合并的达到要求的流感病毒膜蛋白HA和NA纯化液用1000K的超滤膜和PBS进行超滤浓缩和透析,然后用0.2um的膜包进行过滤除菌,即为单价疫苗。 (九）亚单位疫苗检定 包括单向免疫扩散法检验血凝素含量，Lowery法检测总蛋白浓度，病毒灭活验证试验，无菌检查实验等。