炭疽芽胞杆菌的核酸检测.pdfVIP

WS 283—2020 CC 附 录 D （规范性附录） 炭疽芽胞杆菌的核酸检测 D.1 聚合酶链式反应 （PCR）检测炭疽芽胞杆菌特异基因 D.1.1 目标基因 从标本中检测炭疽芽胞杆菌核酸时，以炭疽芽胞杆菌毒素基因和荚膜合成相关基因作为目标基因， 也可选择其他特异性基因。 D.1.2 试剂选择 可使用商品化试剂盒，按操作说明书进行操作，也可按以下步骤进行。 D.1.3 参考引物 参考引物序列见表D.1。合成的引物通常为冻干产品，开盖前应进行短暂离心，使用时需要溶解并 稀释成储存液。按照10 µL/nmol的量加入纯水，即可配制成100 µmol/L储存液，用时稀释10倍即为工 作浓度（10 µmol/L）。 表D.1 PCR 用参考引物序列 序列 扩增片段长度 目标基因 引物名称 (5＇ - 3＇) （bp） pagA F ATTTGCGGTAACACTTCACT 保护性抗原基因 923 pagA R AGACCGTGACAATGATGGAA cap F CCTGGTTGTTCTTTCGTTGC 荚膜合成相关基因 1242 cap R CGGATTGTATATGGAGTGGG D.1.4 模板制备 D.1.4.1 试剂盒法 原始标本使用商品化基因组DNA提取试剂盒，具体操作方法按试剂盒说明进行。 D.1.4.2 煮沸法 已经分离培养的细菌菌落使用煮沸法进行简易模板制备。细菌接种于营养琼脂平板，37℃培养18 h～24 h；刮取菌苔1接种环（约2 µL～5 µL）放入装有800 µL纯水或TE的1.5mL离心管内，混匀；100℃ 加热10 min；12 000 ×g离心10 min；吸取上清用0.22 µm滤器过滤；滤液即为PCR模板。 D.1.5 PCR反应体系 一次总量25 µL 的反应体系包含：酶和缓冲液（2×）12.5 µL，上游引物（10 µmol/L ）和下游引 物（10 µmol/L ）各1 µL，待测模板1 µL～5 µL，用纯水补足体积至25 µL。 9 WS 283—2020 反应设立质控参数：使用纯水作为阴性对照；用已知炭疽芽胞杆菌模板作为阳性对照。加样顺序： 首先加入阴性对照，然后加待测模板，最后加入阳性对照。 D.1.6 PCR扩增 95℃预变性5 min；95℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30个循环；最后72℃延伸 5 min。 D.1.7 PCR扩增产物的检测分析 PCR产物各取5 µL与1 µL上样缓冲液混匀，加入1%琼脂糖凝胶的加样孔内，每块胶上加DNA分子量 标准1～3孔，每孔5 µL，6 V/cm 电泳40 min。 PCR产物也可进行测序分析。 D.1.8 结果判读 在紫外透射仪