医院人感染h7n9禽流感病毒核酸检测规范操作程序.docVIP

医院人感染 禽流感病毒核酸检测 H7N9 标准操作程序 陈 瑜 传染病诊治国家重点实验室 浙江大学附一院检验中心 2013.05.23 目的 ?确保人感染H7N9禽流感病毒核酸检测过程标准化、 规范化，避免因不规范操作对检测结果造成的影 响，保证结果的准确性和可重复性 适用范围 ?医疗机构临床基因扩增实验室按照《关于医院开展 人感染H7N9禽流感病毒核酸检测有关工作的通知》 （卫办医政函〔2013〕383号）和《关于做好医疗 机构人感染H7N9禽流感检测试剂供给保障工作的通 知》（卫发明电〔2013〕29号）有关要求，开展人 感染H7N9禽流感病毒核酸检测工作。 样本种类 ?尽量采集患者发病早期的呼吸道样本： ? 上呼吸道样本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、 咽漱液和鼻洗液； ? 下呼吸道样本包括痰液、气管吸取物、肺洗液、 肺组织等 ?尽量在抗病毒药物使用前采集 ?可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高检 出率 ?患者有下呼吸道样本时，应优先采集 样本种类 ? 已发现H7N9病毒在痰和下呼吸道灌洗液阳性率 高，持续时间长 ? 鼻咽拭子病毒检测阳性率低，持续时间短 痰液标本中病毒能持续 到治疗后第6天，而咽 拭子标本并不能检测到 采集前的准备 ? 采集物品包 采集前的准备 ? 常用的采样液/病毒运输液(VTM） 1. pH 7.4～7.6的Hanks液 2. MEM/DMEM液 ? 若标本需要病毒培养，需在采样液中加入抗菌素，可用青霉素 （终浓度 100U/ml）、庆大霉素（终浓度 1mg/ml）和抗真菌 药物（两性霉素B，终浓度 2μg/ml）。 ? 在无菌的带螺旋塑料管分装2-3ml采样液。最好储存在: –20℃； 4℃可放48–96h，室温1–2天。 ? 采样拭子：使用头部为聚酯纤维的病毒采样拭子（鼻咽 型），铝或塑料做柄，不推荐棉拭子和木柄 样本采集 1. 咽拭子 ? 用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁 桃体及咽后壁，将拭子头浸入含3ml采样液的管中， 尾部弃去，旋紧管盖，贴上标签。 √ × 样本采集 2. 鼻拭子 ? 将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻 腭处，停留片刻后缓慢转动退出。取另一根聚丙烯纤 维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔。上 述两根拭子浸入同一含3ml采样液的管中，尾部弃 去，旋紧管盖，贴上标签。 住院病人标本采集实例 门诊病人标本采集实例 样本包装和运输 ? 人感染H7N9禽流感病毒实验室活动、样本采集和 运输按照《人间传染的病原微生物名录》中高致 病性禽流感病毒进行管理 样本包装和运输 ? 样本采用密封容器包装，立即送往实验室，运输时 在包装箱内填充吸水材料，运输过程中保持样本采 集管直立状态，不能倾斜。 ? 若气温高时，需放入冰块降温。样本抵达实验室 后，应尽快进行检测，24小时内能检测的样本可置 于2～8℃暂时保存，24小时内无法检测的样本则应 置于≤-70℃状态保存。如无-70℃保存条件时，可 于-20℃冰箱暂存。 ? 样本避免反复冻融。 样本包装和运输 专用标本运送箱 PCR检测原理 ? 根据荧光PCR技术原理，针对H7N9禽流感病毒的M基 因、H7基因和N9基因保守区设计特异性引物和 Taqman探针，通过荧光PCR检测仪进行检测，从而 实现对H7N9亚型禽流感病毒RNA的定性检测。 荧光基团 荧光检测元件 M‐forward (GAGTGGCTAAAGACAAGACCAATC), M‐reverse (TTGGACAAAGCGTCTACGC), M‐probe: (FAM‐TCACCGTGCCCAGTGAGCGAG‐BHQ1); H7‐forward(AGAGTCATTRCARAATAGAATACAGAT), H7‐reverse (CACYGCATGTTTCCATTCTT) H7‐probe: (FAM‐AAACATGATGCCCCGAAGCTAAAC‐BHQ1); N9‐forward (GTTCTATGCTCTCAGCCAAGG), N9‐reverse (CTTGACCACCCAATGCATTC) N9‐probe: (HEX‐TAAGCTRGCCACTATCATCACCRCC‐BHQ1). 引物和探针 PCR检测--样本处理 ? 核酸提取应当在样本处理区进行 ? 鼻/咽拭子标本应在保存液中充分搅动 （至少 40 下），以洗脱拭子上粘附 的病毒及含有病毒的细胞等，然后在 4℃，10000rpm 离心20分钟，上清液 用于提取RNA。 PCR检测--样本处理 ? 取适量待检样本、阳性及阴性对照进行核酸提取。 ? 病毒RNA提取可采用Trizol法、硅胶膜吸附法、磁 珠法等，按相应说明书要求进行操作。 ? 提取好的RNA应及时用于检测，否