1生物的核酸提取及常见的问题.pptVIP

生物的核酸提取及常见问题分析 资源环境学院植物病毒研究室 阮小蕾 主要内容 生物的核酸抽提技术 核酸抽提过程中常见的问题分析  生物核酸的抽提技术 DNA提取的一般原则 DNA的提取方法 DNA提取的常见问题分析 RNA的提取原理 RNA的提取方法和注意事项 RNA提取的常见问题分析 DNA提取的一般原则 保证DNA的纯度和一级结构的完整性 排除其他分子（蛋白、多糖、脂类、RNA 、有机溶剂等）的污染，使下游实验顺利进行。 抑制DNase的活性 DNase的抑制剂 加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA2 Na或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。 DNA抽提的方法 基因组DNA的提取 质粒DNA的提取 细胞器DNA的提取 基因组DNA的提取 一些生物基因组DNA的大小 基因组DNA提取的原理 在细胞核内，DNA和组蛋白构成核小体，核小体缠绕成中空的螺旋管状结构，即染色质丝；染色质丝再与很多非组蛋白形成染色体。染色体外有核膜及胞膜。 从组织中提取DNA必须先将组织分散成单个细胞，然后破碎胞膜及核膜，使染色体释放出来，同时去除与DNA结合的组蛋白与非组蛋白。 基因组DNA提取的基本过程 样品的预处理 细胞的裂解 DNA的分离纯化 DNA的洗脱收集 DNA的定量及检测 DNA的贮存 样品的预处理 不同来源的样品，或者同一来源不同形式的样品，其预处理方法不同。 植物材料——液氮研磨 动物材料——匀浆，液氮研磨 培养细胞——蛋白酶K 细菌——溶菌酶破壁 酵母——破壁酶，玻璃珠研磨 细胞的裂解 CTAB法 SDS法 物理方法（机械剪切、超声波破碎、研磨匀浆等） 化学方法（异硫氰酸胍、碱裂解） CTAB法(植物DNA提取的经典方法) 原理 CTAB（cetyltrimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 CTAB抽提缓冲液的经典配方 CTAB法流程图 SDS法—动物/细胞/病毒DNA 原理 SDS 阴离子去垢剂 高温（55～65℃）裂解细胞，蛋白变性，染色体离析 高盐(KAc或NH4Ac) 或降低温度（冰浴） 使蛋白质及多糖杂质沉淀 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提 乙醇沉淀水相中的DNA DNA的纯化 纯化要求： 核酸样品中不应存在对基因工程中的工具酶（内切酶，连接酶，聚合酶等）有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度； 排除其他核酸分子的污染。 纯化方法 吸附材料结合法： 基因组DNA纯化的其它方法 浓盐法 有机溶剂抽提法 密度梯度离心法 DNA分离和纯化的注意事项 尽量简化操作步骤，缩短提取过程； 减少化学物质对DNA的降解； 减少物理物质对DNA的降解； 防止基因组DNA的生物降解。 DNA的贮存 DNA一般用TE（pH8.0）溶液进行长期保存； dd H2o可以作为DNA的暂时保存溶液。 得到的高分子量DNA一般不需要制成干品。 为避免降解，提取的DNA应先进行分装，然后置于-20℃或-70 ℃低温冰箱中保存，同时避免反复冻融。 细胞器DNA的提取方法 线粒体和叶绿体：生物体内的半自主性细胞器，自身可编码蛋白。它们的比重和大小一定，同一离心场内有确定的沉降速度。 故可采用密度梯度离心的方法分离，使用均匀介质（蔗糖、氯化铯等）。 一般方法： 1）从组织中提取叶绿体(cp)或线粒体(mt) 组织匀浆、纱布过滤； 差速离心，上清中含线粒体，沉淀中含叶绿体； DNase处理去除核DNA 2）cp或mt体的纯化：蔗糖浓度梯度离心分离法 3）细胞器裂解 裂解液：80 mL TE【50 mM Tris-Cl (pH7.2) ，20mM EDTA2Na】+20 mL Sarkosyl 溶液 4）CsCl/EtBr密度梯度离心分离cpDNA和mtDNA 也可用CTAB法抽提细胞器DNA，方法同总DNA抽提。 基因组DNA 新鲜材料，低温保存，避免反复冻融。 血液基因组D