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转基因植物和酵母双杂交研究体系构建一、植物转基因体系：1.水稻；2.烟草；3.拟南芥；4.白菜二.烟草表皮瞬时表达体系:1.定位/共定位分析；2.启动子活性分析；3.免疫共沉淀（CoIP）；4.双分子荧光回补（BiFC）；5.萤火虫荧光素酶互补实验（LCI）三.互作体系：1.酵母双杂交（Y2H）；2.酵母单杂交（Y1H）；3.酵母三杂交（Y3H）一、植物转基因体系：（都是通过农杆菌介导）1.水稻（培养愈伤）2.烟草（培养愈伤）3.拟南芥（侵染花）4.白菜（侵染花）1.水稻转基因（周期3个月—从长愈伤到获得T0转基因小苗）1.烟草转基因（周期3个月--从注射到获得T0转基因小苗）3.拟南芥转基因（周期6个月--从种野生型拟南芥到获得T1代转基因阳性种子）阳性农杆菌侵染拟南芥花转化鉴定阳性质粒农杆菌开花可做侵染拟南芥野生型种子置于温室25℃左右16h光照/8h黑暗培养移栽到土中表面消毒4℃春化3天1周左右1个月左右MS平板待种子成熟收T1代种子取叶片提取DNA验证暗培养1天移栽16h光照/8h黑暗培养，直到种子成熟抗性MS平板筛选阳性苗4.白菜转基因（周期6个月--从种野生型白菜到获得T1代转基因阳性种子）二、烟草表皮瞬时表达体系（农杆菌介导（2-3周）--从收到质粒到获得最终数据结果）1.定位/共定位分析：2.启动子活性分析：3.免疫共沉淀(CoIP)分析：4.双分子荧光回补（BiFC）：5.萤火虫荧光素酶互补实验（LCI）：1.激光共聚焦显微镜观察2.GUS染色阳性农杆菌注射或共注射烟草转化鉴定阳性3-5天质粒农杆菌取样3.提取蛋白，WB和IP分析4.激光共聚焦显微镜观察5.荧光素酶底物染色1.定位/共定位分析：目的基因简单的定位分析目的基因与胞内各种中Marker的共定位分析2.启动子活性分析：3.免疫共沉淀(CoIP)分析(验证互作) ：4.双分子荧光回补（BiFC） (验证互作) ：5.萤火虫荧光素酶互补实验（LCI） (验证互作) ：三、酵母互作体系：1.酵母双杂交（Y2H）：2.酵母单杂交（Y1H）：3.酵母三杂交（Y3H）：1.酵母双杂交（Y2H）：（文库建立、文库筛选、互作验证）……A.文库建立（1-2周---从收到物种材料到获得酵母文库菌）:步骤1.? 用SMART技术从RNA反转出cDNA。步骤2.? 将线性化的pGADT7-Rec载体和cDNA共转化到酵母Y187中，铺于SD/–Leu平板。步骤3.? 于30℃生长4-5天后，收集酵母菌。步骤4.?分装1ml/管文库菌，冻存。步骤5.? 用1ml文库菌进行酵母双杂交筛库。……B.文库筛选（3-4周---从收到诱饵质粒和文库菌到获得4缺平板验证的结果）:? Step 1. 设置对照实验。? Step 2. 克隆及检测诱饵蛋白自激活和毒性。? Step 3. 诱饵和文库菌共培养后，涂平板。? Step 4. 确定互作结果。……B.文库筛选（2-3周--从收到4缺平板到获得测序结果） :? 酵母克隆PCR验证。? 提取酵母质粒，并转化大肠杆菌，送测序。? 挑取感兴趣的基因，做进一步互作验证……C.互作验证（1-2周--从收到质粒到获得数据结果 ）:1.BD-Bait+AD-prey2.BD-Bait+AD3.BD+AD-prey4.BD-Lam+AD-T（阴性）5. 4.BD-p53+AD-T(阳性)共转化酵母(AH109)，在2缺和4缺上验证互作结果1.酵母单杂交（Y1H）： （文库建立、文库筛选、互作验证）……A.文库建立和文库筛选（3-4周）:Step 1. 将目标序列（Bait）克隆至pAbAi载体。Step 2. 将pAbAi-Bait质粒酶切，并转化到酵母菌Y1HGold的基因组中Step 3. 检测pAbAi-Bait阳性菌的表达Step 4.用SMART技术从RNA反转出cDNA。Step 5.将线性化的pGADT7-Rec载体和cDNA共转化到酵母pAbAi-Bait阳性菌中，铺于SD/–Leu/AbA平板。Step 5. 确定筛库结果，提取酵母质粒，转化大肠杆菌，测序。……C.互作验证（1-2周--从收到质粒到获得数据结果）:1.AD-prey2. AD转化pAbAi-Bait酵母(Y1HGold)，在1缺上验证互作结果1.酵母三杂交（Y3H）：（互作验证）（1-2周--从收到质粒到获得数据结果）1.BD-Bait+AD-prey+ pYES-3rd2.BD-Bait+AD-prey+pYES共转化酵母，在4缺上验证互作结果谢谢大家！