医学流式细胞术及其应用 生化经典.pptVIP

样品 培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋 单细胞 悬液 标记 荧光抗体 检测 表型测定 细胞分选 流式细胞术操作流程 统计学 分析 继续 培养 第 二 部 分 流式细胞术在不同领域的应用 细 胞 周 期 分 析 流式细胞术及其应用 第 一 部 分 流式细胞术的一般介绍 概念 ? 流式细胞术 （ Flow Cytometry ， FCM ） 利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单 细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特 定群体加以分选的现代细胞分析技术。 ? 流式细胞仪 （ Flow Cytometer) 集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算 机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的 一种新型高科技仪器。 流式细胞仪特点 单细胞悬液 或生物颗粒 分析速度高 多参数 精度高 当代最先进的细 胞定量分析技术 FACSCalibur 特点： ? 光路调节系统固定 ? 自动化程度高 ? 操作简便 ? 使用寿命长 ? 配备 1-2 根激光 ? 细胞分选速度慢， 主要用于细胞分析 临床型（台式机） BD LSR FACS Vantage DiVa 科研型（大型机） 特点： ? 多数字化 ? 适用用各类细胞分选 ? 4 路分选 FACSAria 科研型 特点： ? 分辨率高 ? 选配多种波长和 类型激光器 ? 可把感兴趣细胞 分选到特定培养孔 或板上（ 4 路和 24 孔板） ? 适用于高速分选 和多色分析 流式细胞仪检测范围 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA 含量与细胞周期 RNA 含量 蛋白质含量 细 胞 结 构 特异性抗原 （细胞表面 / 胞浆 / 核） 细胞内细胞因子 细胞活性 酶活性 激素结合位点 细胞受体 细 胞 功 能 临床研究 淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细 胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、 HLA- B27 分析、 PNH 诊断、人类同种异体器官移 植中应用、细胞因子测定、 AIDS 诊断与治疗 和疗效评价、 flow-FISH 法测定端粒长度 基础研究 淋巴细胞功能、树突状细胞（ DC ）研究、造 血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分 析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多 药耐药基因研究（ MDR ）、肿瘤相关基因表 达研究、 RNA 测定、 DNA 测定、总蛋白测定、 癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮 细胞研究 流式细胞仪的工作原理 ? 光学系统 激光光源 光收集系统 ? 液流系统 流动室 液流驱动系统 ? 电子系统 光电转换 数据处理系统 ? 细胞分选系统 激光光源 ? 单波长、高强度、高稳定性 ? 多采用氩离子激光器或氦氖激光器 ? 一般选配 2-4 根激光， 488nm 、 633nm 和 355nm 、 407nmUV 激光 ? 最多检测 13 个荧光参数 Longpass Shortpass Bandpass 460 500 540 460 500 540 460 500 540 SP 500 LP 500 BP500/50 光收集系统：滤光片 光收集系统：光电倍增管（ PMT ） FACSCalibur 光路图 液流系统：流动室、液流驱动系统 液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱 细胞分选系统 Fluorescence Activated Cell Sorting 488 nm laser + - Charged Plates Single cells sorted into test tubes FALS Sensor Fluorescence detector 信号检测 -- 散色光 FSC （小角散射 ) 光它 反应细胞的相对大小 和截面积的大小 SSC (90 度角散射光 ) 代表细胞的颗粒度和 精细结构的变化 全血细胞流式 FSC-SSC 图 它反应细胞的物理特性 , 根据前侧向散射 光，可以把不同类型的细胞群加以区分 信号检测 -- 荧光信号 自发荧光 特异荧光 特异荧光 能量级 激发 激发态 发射 激光 能量损失 数据显示类型 单参数直方图 （ Histogram ） X 轴：代表荧光信号或 散射光信号的强度，用 “通道数”表示，可以 与光强度之间线性关系 或对数关系 Y 轴：代表该通道内所 出现具有相同光信号特 征性细胞的频率 二维等高图和密度图 Pseudo 3D Plot 3D Plot 二维点图 Dot Plot ? 便于数据统计 ? 不同的细胞群 可以用不同的颜 色标记 ? 主要表达方式 光谱交叉 Emission wavelength (nm) 530 580 630 680 730 780 F