从全血和体液中提取基因组DNA的操作步骤.docVIP

PAGE PAGE 1 从全血和体液中提取基因组DNA的操作步骤 提取DNA需要的仪器和试剂： ⑴ 1.5ml 离心管 ⑵ 移液管: 1000ul, 200ul, 40ul 各一支和移液管尖头: 100-1000ul, 1-200ul 各一盒 ⑶ 微型滤柱（备用） ⑷ 小型旋转混合器一台 o⑸ 小型离心机: 可放入1.5ml 离心管和2ml收集管. o oo⑹ 恒温水浴 o o ⑺ 电冰箱: -20 C, 4 C ⑻ 无水乙醇(自备) ⑼ 70% 乙醇(自备) ⑽ 利普生DNA提取试剂盒。内含: ⑴ 裂解液1 ⑵ 裂解液2 ⑶消化液 ⑷纯化液 ⑸弥散液 ⑹蛋白酶K ⑺ 带钩细玻棒一盒 ⑻ 微型滤柱若干。 提取DNA前注意： o⑴ 使血样品内容物达到室温（15 – 25 C ）。 o o⑵ 预热水浴到58 C， 为步骤3作准备。 o ⑶ 置弥散液于58 C内，为步骤4或步骤7作准备。 ⑷ 所有的离心步骤均在室温下进行。 ⑸ lml全血可提得15-60ug DNA。 一．从1ml全血或体液中提取DNA的步骤： ⑴ 裂解1： 取1ml全血，血桨，血清，淋巴细胞放入到1.5ml的离心管中，加入400ul裂解液1。上下翻转，使沉淀物分散，旋转脉动15秒后放入离心机中离心，离心速率为8000rpm，1min.。倒掉上层液，可见离心管底部有血色沉淀。重复此裂解步骤一次，这次是加入1ml裂解液1。 最后用移液管吸净所有上层液弃去, 以使离心管底部的血色沉淀不再残留有裂解液1。 ⑵ 裂解2: 在上面离心管中加入1ml裂解液2。上下翻转，务必使沉淀物分散， 旋转脉动15秒后放入离心机中离心，8000rpm，1 min.。 倒掉上清液，可见离心管底部有微量淡红色沉淀。重复此裂解步骤一次，这次仍然是加入1ml裂解液2，最后用移液管吸净所有上清液弃去，以使离心管底部的灰白色沉淀不再残留有裂解液2。 o⑶ 消化： 吸取蛋白酶K 10ul ( = 0.2mg )加入到上面的离心管中，用移液管尖头反复吹打， 使蛋白酶K与沉淀物均匀接触后， 加入320ul消化液，上下翻转离心管， 务必使沉淀物分散于消化液中。放入58 C水浴中消化15分钟。最后可见澄明的消化液体。 o ⑷ 纯化：在上面的消化液体中加入110ul纯化液， 上下翻转离心管几下后， 离心，速率为15000rpm, 1min， 把上清液吸出放入到装有1000ul无水乙醇的1.5ml离心管中，轻轻上下翻转10次， 可见絮状DNA析出。用带钩的玻璃棒挑起絮状DNA放入到100ul 70%乙醇中耒回漂洗20次，钩出DNA，在空气中凉干一下后放入到100ul弥散液中。把DNA弥散液保存于4 C，过夜， 使之充分弥散后使用。提取完毕。 oo如要立即用此DNA做PCR实验，把DNA弥散液放在58 C水浴中，保温30分钟, 用手指拍打离心管子，使DNA弥散后使用。提取完毕 o o ⑸ 收集：(在DNA极少量， 不能用带钩玻璃棒挑起的情况下) 把有絮状DNA的溶液倒入微型柱过滤器(包括滤柱和收集管)中， 滤器放入离心机内，离心: 8000rpm , 1 min.. DNA便附着在滤漠上，弃去滤液，把滤柱放回收集管上。 ⑹ 吸取200ul 70%乙醇于滤柱内，离心8000rpm ，1min， 弃去滤液。把滤柱放回收集管上，再离心 15000rpm ，1 min.. 使吸附在滤膜上的DNA不再附有乙醇。 oo⑺ 回收DNA: 把上面附着DNA的滤柱放入一个干净的1.5ml 离心管中。 吸取100ul 已温热到58 C的弥散液，轻轻放入滤膜的表面， 保温58 C静置10分钟。 离心 8000rpm ，1 min.，DNA弥散液便滤入到干净的1.5ml离心管内。此DNA弥散液可即时作PCR实验用。提取完毕。 o o o附：如从2ml全血中提出取DNA，方法和步骤与从1ml全血一样，只是在步骤⑷ 纯化之前，把两个1ml全血的消化液管内容物合并后，加入220ul纯化液，上下翻转离心管几下后， 离心，速率为15000rpm, 1min， 把上清液吸出放入到装有1800ul无水乙醇的2ml管中，轻轻上下翻转10次， 可见絮状DNA析出。用带钩的玻璃棒挑起絮状DNA放入到200ul 70%乙醇中耒回漂洗20次，钩出DNA，在空气中凉干一下后放入到100ul弥散液中。把DNA弥散液保存于4 C，过夜， 使之充分弥散后使用。提取完毕。 o 如要立即用此DNA做PCR实验，把DNA弥散液放在58 C水浴中，保温30分钟, 用手指拍打离心管子，使DNA弥散后使用。提取完毕 从200ul全血或体液中提取基因组DNA的操作步骤 ⑴裂解1： 取200ul全