I型超敏反应实验设计讲课教案.ppt

IL-12抗I型超敏反应的实验探究;实验目的;实验原理;IL-12刺激Th2向Th1转化，下调IgE;ELISA原理;动物：Wistar大鼠12只,体重200～220 g，雄雌各半，随机分5组，即正常组1只、模型组1只、实验组10只。 药物:鼠IL-12 试剂：鸡卵白蛋白, ,抗鼠1gE抗体，抗鼠IL-4抗体，抗鼠IFN-γ抗体，酶标抗体，底物，生理盐水。 仪器:微孔板，酶标分析仪，离心机。;实验流程; 1、正常组：1只 未经处理的对鸡卵清蛋白不过敏 的wistar大鼠 2、模型组：1只 经鸡卵清蛋白致敏的wistar大鼠 3、实验组：10只 经鸡卵清蛋白致敏的wistar大鼠 ps：模型组和实验组均是用鸡卵白蛋白与氢氧化铝悬液的混合液致敏和诱发，制成的Ⅰ型超敏反应动物模型。 ; 1、取50 μg鸡卵清蛋白制成5mL 10μg /mL的溶液（溶于生理盐水中） 2、制备800 μg /mL的IL-12，按照下图做倍比稀释（IL-12稀释于鸡卵清蛋白中） ; 1、正常组不做处理 2、模型组和实验组于致敏两周后,腹腔内注射药物 （鸡卵清蛋白+IL-12）50μL;1、用眼眶取血法取外周血，离心取上清液;1、包被抗体：抗体（抗鼠IgE抗体）用包被液稀释好后100μl/孔加样，37℃孵育1ｈ或者4℃过夜，之后用超纯水洗三遍，在干燥的吸水纸上拍除多余的水分。 2、封闭：加1%的脱脂奶粉，200μl/孔，37℃放置1ｈ或者4℃过夜，之后甩干，不洗，此时的抗体板子可以直接使用。 3、加抗原IgE：每孔加100μl需要检测的IgE于已经封闭好的酶标板，小心吹除气泡，37℃孵育1ｈ或者4℃过夜，之后用PBS洗三遍，在干燥的吸水纸上拍除多余的水分。 4、加酶标抗体：酶标抗体50μl/孔加于酶标板，37℃放置1ｈ，之后用PBS洗三遍，必要时要进行适当的浸泡，在干燥的吸水纸上拍除多余的水分。 5、显色：显色底物加于酶标板，100μl/孔，37℃孵育15min后用1滴的硫酸终止显色反应。 6.重复ELISA实验，检测小鼠血清中IFN-γ和IL-4的浓度变化 7.数据分析，用酶标分析仪读出血清中IgE、IFN-γ和IL-4的效价;预期结果;实验讨论;2.模型组致敏成功 个体差异、IL-12和变应原注射顺序、注射和取血距致敏的时间、注射方式、剂量。;二、IL-12与变应原注射顺序不同--致敏前、同时或之后注射IL-12,可能导致不同的??果 三、用以检测IL-4、IFN-γ和IgE的其他方法：RT-PCR、ELISPOT ;前景探究;参考文献