分子病理学常用研究方法 .ppt

分子病理学常用研究方法 (一);基因变异的诊断 ; Southern blot , PCR, RT-PCR, Real-Time RT-PCR, FISH;检测基因的丢失和扩增 比较基因组杂交 Comparative Genomic Hybridization,CGH 分子生物学技术与细胞遗传学方法相结合 优点： 1. 新鲜材料和福尔马林固定石蜡包埋材料均可 进行CGH研究 2. 被测样品只需数mg甚至不到1 mg的DNA;;CGH的应用： 为搜寻肿瘤的癌基因或抑癌基因确定范围 肿瘤细胞染色体某一位置上DNA序列拷贝数增加，往往提示该位置可能包含已知或未知的癌基因有扩增 肿瘤细胞染色体某一位置上DNA序列拷贝数减少或缺失，提示该位置可能包含已知或未知的抑癌基因丢失 CGH发现MYCN，MET与胃癌相关;区分良恶性病变，临床上估计预后 16例前列腺癌CGH显示染色体异常占81% 5例良性前列腺增生全部阴性 67肝细胞癌CGH显示:1q,8q,20q,17q ↑ 4q,8p,13q,16q ↓ 12例癌周肝硬化组织：阴性 53例淋巴结阴性乳腺癌：8q,11q13,17q,20q异常，预后差 ;蛋白组学及生物芯片 ;生物芯片（biochip) 是指采用光导原位合成或微量点样等方法将大量核酸片段（寡核苷酸、cDNA、基因组DNA、RNA）或多肽分子甚至细胞等生物样品有序地固定于支持物（玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集的二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量改变。 ;生物芯片： 基因芯片 蛋白质芯片 细胞芯片 组织芯片 基因芯片( Affymetrix 专利） 寡核苷酸芯片，cDNA芯片，基因组芯片 DNA microarray:阵密度很高的玻片基质或胶膜基质 的DNA微阵列 DNA macroarray:阵密度较低的尼龙膜DNA微阵列 ;杂交组织化学-概述;;核酸分子杂交种类：固相杂交 (硝酸纤维素膜或尼龙膜) Southern印迹转移(DNA) Northern印迹转移(RNA) 液相杂交 原位杂交 原位杂交四要素： 适当的探针 良好的组织材料 可靠的试剂和方法 相当的形态学基础;二、探针的制备 1.探针的种类和制备 DNA探针：应用多，操作容易 比较敏感，背景高(自身网络) 双链DNA探针用时要变性 整合 转化 扩增 DNA片段 ─── 质粒(或其他载体) ─── 细菌─── 提取 酶切 ─── 质粒 ─── 探针 ( PCR 扩增 );线性质粒; RNA探针：结合稳定，穿透性好 无需变性，不存在退火问题 未杂交探针可用RNase去除，背景好 多采用体外转录法合成同时加以标记 寡核苷酸探针：合成快速，不用变性，对RNase不敏感 30-150bp，组织通透性好