重组人Leptin的表达、纯化及免疫学与生物学活性鉴定.docVIP

重组人Leptin的表达、纯化及免疫学与生物学活性鉴定 张 砡，王晓辉，冯泽国 （解放军总医院麻醉手术中心 北京 100853） 【摘要】目的：为了获得重组人Leptin（rh-leptin）蛋白高表达的菌株及大量具有生物活性的rh-leptin蛋白，构建Leptin重组表达载体，转化感受态细菌进行表达，对rh-leptin蛋白进行复性及纯化，并鉴定其免疫学及生物学活性。方法：提取脂肪组织RNA，通过RT-PCR方法获得用PCR方法扩增人Leptin的编码区，使产物与pGEM-T easy载体相连，转染DH5α。测序后,选出阳性克隆质粒扩增。将酶切后的leptin片段与pET-28a(+)载体连接，获得leptin的表达质粒。将重组表达质粒转入BL21(DE3)，测序结果显示Leptin编码区没有突变产生，用IPTG诱导leptin重组蛋白表达。表达产物进行SDS电泳及Western印迹杂交进行免疫学分析。并通过Km小鼠减肥实验及胃肠推进率测定实验检验其生物学活性。结果：在包涵体蛋白22 kDa处有明显的新增蛋白带,其含量超过总蛋白的50％；经Western-blot证实为重组的人leptin蛋白。大量表达后，经蛋白复性和纯化，通过Km小鼠减肥实验及胃肠推进率测定实验证实重组表达的人Leptin蛋白具有生物学活性。结论：成功构建了rh－leptin的高表达菌株，建立了rh－lept