蛋白质含量测定方法大全.doc

实验一 蛋白质含量测定 本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原 理和优缺点。 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前 常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret 法）、Folin－酚试剂 法（Lowry 法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法， 即考马斯亮蓝法（Bradford 法）。其中 Bradford 法和 Lowry 法灵敏度最高，比紫外 吸收法灵敏 10～20 倍，比 Biuret 法灵敏 100 倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较 准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质， 因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法 都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的 灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的 时间。 考马斯亮蓝法（Bradford 法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成 硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和 的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： CH2COOH | + 3H2SO4 → 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1) NH2 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4 + 2NaOH → 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入 CuSO4 作催化剂，K2SO4 以提高溶液的沸点。收集氨可 用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋 白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以 6．25 即 得。 五种蛋白质测定方法比较如下： 方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法 灵 敏 度 低 ， 费 时 将蛋白氮转化 非 蛋 白 氮 用于标准蛋白 (Kjedahl 法 适用于 0.2~ 8-10 为氨，用酸吸 （可用三氯 质含量的准确 ) 1.0mg 氮，误 小时 收后滴定 乙酸沉淀蛋 测定；干扰少； 差为 ±2％ 白 质 而 分 费时太长 离） 双 缩 脲 法 灵 敏 度 低 中 速 多肽键＋碱性 硫 酸 铵 ； 用 于 快 速 测 （Biuret 法） 1～20mg 20~30 Tris 缓 冲 定，但不太灵 Cu2 ＋ → 紫 色 分钟 络合物 液；某些氨 敏；不同蛋白 基酸 质显色相似 紫外吸收法 较为灵敏 快速 蛋白质中的酪 各种嘌吟和 用于层析 50～100μg 5 ～ 10 氨酸和色氨酸 嘧啶； 柱流出液的检 分钟 残 基 在 280nm 各种核苷酸 测；核酸的吸 处的光吸收 收可以校正 Folin － 酚 灵敏度高 慢 速 双缩脲反 硫酸铵； 耗 费 时 间 长 ； 试 剂 法 40 ～ 应；磷钼酸－ Tris 缓 冲 操作要严格计 ～5μg （Lowry 法） 60 分 磷钨酸试剂被 液； 时； 钟 Tyr 和 Phe 还原 甘氨酸； 颜色深浅随不 各种硫醇 同蛋白质变化 考马斯亮蓝 灵敏度最高 快速 考马斯亮蓝染 强碱性缓冲 最好的方法； 法 5 ～ 15 料与蛋白质结 液； 干扰物质少； 1～5μg (Bradford 分钟 TritonX- 颜色稳定； 合时，其λmax 法) 由 465nm 变为 100; 颜色深浅随不 595nm SDS 同蛋白质变化 二、双缩脲法（Biuret 法） （一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两 个分子脲经 180℃左右加热，放出一个分子氨后 得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与 CuSO4 形成紫色络合物，称为双缩脲反应。 凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这 类化合物都有双缩脲反应。 H2O O=C C=O HN NH R-CH CH-R O=C Cu C=O HN NH R-CH CH-R H2O 紫色络合物 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸 成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为 1~10mg 蛋白质。干扰这一测定的 物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质 少。主要的缺点是