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LAMP技术原理及应用 陈 蕾 北京蓝谱生物科技有限公司 E-mail: chenlei@ Tel: 0101 Mob:1 基因检测的流程 从样本中抽取、提纯 DNA、RNA PCR LAMP 一步反应 二步反应 基因扩增 扩增 扩增 检测 检测 检 测 2 LAMP法和PCR法的比较 LAMP PCR 温 度 ◎ 反应全程恒温 △ 必须要有热循环 时 间 ◎ 约１５～６０分钟 △ ２～３小时 产 物 量 ◎ 约１０１０倍 (100亿倍) △ 约１０７倍 (1千万倍) 特 异 性 ◎ 极高 ６区域 ４ 引物 △ ２区域 ２ 引物 无需其他检测步骤， 检 测 ◎ 根据扩增反应发生与 △ 需其他检测步骤 否判断 试 剂 ◎ 无需特殊试剂 ◎ 无需特殊试剂 简单、快速、准确的基因扩增法 3 LAMP法的引物设计 4 LAMP法使用的酶 链置换型DNA聚合酶: Bst DNA Polymerase ?扩增对象为双链DNA时，其中一条链解离的同时进行链伸长。 ?LAMP法使用最适温度65℃的聚合酶。 引物 双链DNA 聚 引物 聚 双链DNA解离的同时??? ① ② 解离下来的单链DNA 引物 聚 持续链伸长 ③ 5 LAMP法的原理 ① (4) 哑铃状模板构造的形成过程 3’ F3c F2c F1c B1 B2 B3 5’ 3’ F3c F2c F1c Target DNA B1 B2 B3 5’ 5’ 3’ F3 F2 F1 B1c B2c B3c ＋ 5’ 3’ w解离链 5’ F3 F2 F1 B1c B2c B3c 3’ F1c F2 F1 B1c B2c B3c (1) 3’ F3c F2c F1c B1 B2 B3 5’ F1c 5’ F2 3’ FIPw结合 (5) (6) F1 B1c B2c B3c 3’ 5’ B1c F2 3’ B2 5’ F1c w环状构造 BIPw结合 5’ F1c F2 F1 B1c B2c B3c 3’ (2) 3’ F3c F2c F1c B1 B2 B3 5’ 5’ F2 F1 B1c B2c B3c 3’ F1c (7) B3 Primer 3’ F1 F2c F1c B2 B1c 5w’ 结合 5’ F1c F2 F1 B1c B2c B3c 3’ (3) 3’ F3c F2c F1c B1 B2 B3 5’ F2 F1 B1c B2c B3c 3’ F1c 5’ F3 Primer w结合 (8) 3’ 5’ F1 F2c F1c B1 B2 B3 ＋ F1c B1 w解离连 B2 F2c 5’ 3’ F1 B1c w环状构造 w环状构造 6 LAMP法的原理 ② 扩增循环 (8) B1 F1c F1 F2 F1 B1c F1c F1c FIP F2c B1 B2 F1 B1c B2c F1c F2c F2 B2 F2c F2 F1c F1 FIP B1c F1c B1 (9) F1c B1 B2 B1c F1c F2 F1 B1c F2c F2 F1 F1c B1c B1 B2c B1 F1 F2c F1c F1 B1 B2 B1c B2c B2 B2c F2c F2 F1 B1c F1c B1 F1c B1 B2 B1c F1 B1c F2c F2 F1 F1c B1c BIP B1 B1c B2 B2c B1 B2c F2 F1c B1 BIP B2 B1c B2c F1 B1c (10) (11) 7 アニメーション 8 环引物的应用 ① F1c (8) Loop Primer B B1 F2 F2c F1 3’ 5’ B1c B2 F1c Loop Primer F (11) F1 B1c F2 5’ F1c 3’ B1 B2c B2 B1c 9 环引物的应用 ② RNA PSA 癌症转移标志基因 CYP2C19 公牛特异性序列 DNA HBV λDNA 快速法（Loop Primer ：有） 标准法（Loop Primer ：无） 10 LAMP法结果判断方式① ----目视检查混浊 dNTPs DNA Polymerase Mg2+, DNA DNA-(dNMP)n + nPPi PPi = P2O7 P2O74- + 2 Mg2+ Mg2P2O7 ( White precipitate) LAMP法结果判断方式① ----目视检查混浊 dNTPs DNA Polymerase Mg2+, DNA DNA-(dNMP)n + nPPi PPi = P2O7 P2O74- + 2 Mg2+ Mg2P2O7 ( White precipitate) LAMP法结果判断方式② UV ----