takara反转录试剂盒使用说明书.doc

Code No. RR047A 研究用 PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 说明书 v201512Da 目 录 内 容 页 码 ● 制品说明 1 ● 制品内容 1 ● 试剂盒外必备材料 1 ● 保 存 1 ● 特 长 2 ● 使用注意 2 ● 操作方法 2 ● Real Time PCR 4 ● 实验例 6 ● 附 录 7 ● 关联产品 8 ● 制品说明 为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有 cDNA作为模板检出的先决条件，但 Total RNA中常常 混有基因组 DNA，并可以直接作为 PCR反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。为了避免这 种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组 DNA得不到扩增。但是，此方 法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存 在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本 方法。在这种情况下，我们常常需要对 Total RNA样品进行 DNase I处理，以除去残存的基因组 DNA。 而 DNase I处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成 RNA的降解和损失。 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因组 DNA进行 Real Time RT-PCR反 应的专用反转录试剂。Kit中使用了具有较强 DNA分解活性的 gDNA Eraser，通过 42℃，2 min即可除 去基因组 DNA。同时由于反转录试剂中含有抑制 DNA分解酶活性的组分，经过 gDNA Eraser处理后的 样品可以直接进行 15 min的反转录反应合成 cDNA，因此，20 min内即可迅速完成从基因组 DNA去除 到 cDNA合成的全过程。 使用本制品合成的cDNA适用于SYBR? Green分析法和TaqMan?探针分析法，可以根据实验目的，选择 与SYBR Premix Ex Taq? II（Tli RNaseH Plus）（Code No. RR820Q/A/B）、Probe qPCR Mix（Code No. RR391S/A/B）组合使用。 注意：Takara Bio使用 SYBR? Green I作为研究试剂已得到 Molecular Probes Inc.的许可。 SYBR?为 Molecular Probes Inc.的注册商标。 ● 制品内容（20 μl反应×100次） 1. gDNA Eraser 100 μl 2. 5×gDNA Eraser Buffer*1 200 μl 3. PrimeScript RT Enzyme Mix I*2 100 μl 4. 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）*3 400 μl 5. RT Primer Mix*4 400 μl 6. RNase Free dH2O 1 ml×2 7. EASY Dilution（for Real Time PCR）*5 1 ml *1： 5×gDNA Eraser Buffer在反转录反应前使用，请务必进行基因组 DNA的除去反应。 *2： 含有 RNase Inhibitor。 *3： 含有 dNTP Mixture。 *4： 含有 Oligo dT Primer和 Random 6 mers。 *5： 制作标准曲线时梯度稀释 cDNA或 RNA标准品的稀释液。模板 DNA或 RNA如果用水或 TE Buffer稀释时，由于受 Microtube吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验结果精 度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围内获得准确定 量的标准曲线。本制品不影响反转录和 PCR反应，用其稀释后的样品可直接使用。EASY Dilution （for Real Time PCR）（Code No. 9160）也可以单独购买。 注意：EASY Dilution（for Real Time PCR）请与本公司 Real Time PCR 试剂组合使用，对于 其他公司的同类制品的适用性本公司尚未进行确认。 ● 试剂盒外必备材料 热循环仪（或 37℃水浴，42℃水浴和 85℃加热块） 反转录反应所用 0.2 ml和 1.5 ml的微量反应管 微量移液器和枪头（高压灭菌） ● 保 存： -20℃。 -1- ● 特 长 1． 含有去除基因组 DNA的 gDNA Eraser，只需 2 min即可除去基因组 DNA。 2． 只需 15 min即可高效合成 Real Tim