DNA芯片技术简介.docVIP

专／题／策／划 ＤＮＡ芯片技术简介 北京大学生物信息中心　　何坤　　高歌　／文 １９９０年，著名的人类基因组测ＨＧＰ）正式启动，从此揭开了基因组时代的序幕。截至２００６年８月，美Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）收录的已完成基因组测序的物种数目为３８９个，正在进行序列拼接且测序完成的有３４１个，另外还有４６３个物种正在进行测序。 基因组测序的完成，为我们提供了生命的第一套密码。从基因组数据中提取蕴藏的大量信息，阐明千变万化的生命现象，是生物学家所面临的更大挑战。众所周知，生命活动的基本单位是细胞，人体中数百种细胞分工合作，形成各种组织和器官，最终组合成一个完整的个体。 生物体中，每个细胞内都有一套完整的基因组，为实现正常生物功能，生物体在不同环境、不同发育阶段，选择不同基因适度表达。即使是最简单的生物也有数百个基因，这些基因遵循一定的表达调控 机制，依照特定的时空顺序进行有个特定细胞中所有表达基因的组合，最终限定了这个细胞的生物学着重研究高度复杂精确的基因表达调控过程。通过对不同细胞类型之间表达模式差异的研究，转录组学试图从动态的角度刻画出一幅生命活动的“动画”。 随着基因组数据的增长，ＤＮＡ芯片（ＤＮＡ　Ｃｈｉｐ）技术得到广泛应用。ＤＮＡ芯片也称基因芯片（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）、生物芯片（Ｂｉｏｃｈｉｐ）或微阵列（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）。２０世纪９０年代中叶ＤＮＡ芯片技术出现前，传统分子生物学技术通常只能同时对少数几个基因的表达情况进行研究。决定生物形态或某种生物现象通常是成百上千的基因共同作用的结果，作为一种能够获得大量基因表达图谱的高通量技术，ＤＮＡ芯片应运而生。 中Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交等实验技术相似，都是利用ＤＮＡ双螺旋序列的互补性，即两条寡聚核苷酸链以碱基之间形成氢键配对（Ａ与Ｔ配对，形个氢键）。ＤＮＡ芯片通常以尼龙膜、玻璃、塑料、硅片等为基质材料，固着特定序列ＤＮＡ单链探针（Ｏｌｉｇｏ），并与被检测序列单链ｃＤＮＡ序列互补结合（通常称杂交）。被检测序列用生物素或荧光染料标记，通过荧光染料信号强度，可推算每个探针对应的样品量。一张ＤＮＡ芯片，可固着成千上万个探针，具体数目则取决于芯片设计和制备方法。 根据制备方法，ＤＮＡ芯片主要可以分成三类： １）　利用机械装置将ｃＤＮＡ序列或者其他ＰＣＲ产物点在芯片上作为探针； ２）　利用机械装置将事先合成的寡核苷酸链序列点在芯片上作为探针； ３）　不事先合成寡核苷酸链，而直接在芯片上通过原位合成技术同时合成所有探针。 后两种方法，需要综合考虑探 序计划（Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔ，序的表达。在一个特定的时刻，一 转录组学（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ）成两个氢键；Ｇ与Ｃ配对，形成三国国立生物技术信息中心（ＮＣＢＩ，功能。 一、　ＤＮＡ芯片原理 ＤＮＡ芯片的基本原理与生物学 １９ 专／题／策／划 针的灵敏性（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）和特异性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ），避免非特异性杂交干扰结果；此外还需要考虑ＧＣ含量以及退火反应温度，以保证整个芯片可在相同条件下进行杂交实验，所 肿瘤细胞与正常细胞间、动物服用药物前后等不同情况下基因表达差异，在植物学研究中研究抗旱、抗病种系与普通种系的基因表达差异等。以双色ＤＮＡ芯片系统进行基因 为５０，则信号强度为１００，则信噪比过低；反之，若信号强度为１００００，信噪比大大加强。 ５）　整合两种不同颜色强度可得到虚拟图谱，绿色点表示处理后的细胞中该基因表达量高，红色点反之，黄色点表示处理前后表达水平相当，而黑色点则说明两个颜色标记的样品均无表达，如图１所示。 图１右下角为一张ＤＮＡ芯片扫描结果，左上角为局部放大。绿色点表示处理后的细胞中该基因表达量高，红色点反之，黄色点表示则说明两个颜色标记的样品均无表达。 需要注意的是杂交强度不仅代表基因表达水平实际差异，还可能受非特异性杂交影响。为尽量排除这种因素，Ａｆｆｙｍｅｔｉｒｘ芯片中设计了不匹配核苷酸探针作矫正依据。此外，染料效率不同带来的系统误差需用均一化方法进行矫正。 ＤＮＡ芯片作为一种高通量实验技术，不可避免地存在较大误差，也难以像传统生物学实验那样给出确定结果。因而，最初ＤＮＡ芯片技 有探针都有比较一致的杂交效率。表达量检测实验为例，一般ＤＮＡ芯不同方法生产的芯片探针长度不一，片实验步骤包括以下几步。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ公司的芯片采用短探针，只有２５个核苷酸；而ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ公司所用探针相对较长，可达７０个核苷酸。一般来说原位合成芯片可在同一张芯片内容纳更多探针。 除Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ公司生产的芯片外，其他芯片多采用双色杂交系统，即使用Ｃｙ５（红）和Ｃｙ３（绿）两种染料分别标记所比较两种样品的ｃＤＮＡ序列，然后杂交至