等电聚焦电泳教案资料.ppt

等 电 聚 焦 电 泳;一、IEFE 定义 ; 各种蛋白质各自都有一个等电点,在一特殊的pH环境中,蛋白质分子呈电中性,在电场中不会迁移。 等电聚焦就是在电泳介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。;二、IEFE的特点;（二）缺点 1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋 白质可能发生沉淀。 2.样品中的成分必须停留在其pI，不适用 在pI不溶或发生变性的蛋白质。 ; 分辨率较不连续PAGE更高，特别适合于分离分子量相同而电荷不同的生物大分子。;三、IEFE的基本原理;蛋白质分子在不同pH下的解离状态; 在电泳介质中放入载体两性电解质，当通入直流电时，两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，正极附近是低pH区，负极附近是高pH区。;蛋白质分子的电聚焦过程 ; 在这个从正极到负极pH逐渐增加的直流电场中，当蛋白质进入这个环境，不同的蛋白质带上不同性质和数量的电荷，向着一定方向移动，迁移到与其相同的等电点位置上停留下来，即被聚焦于一个狭的区带中 ，得以分离。 ;进行IEFE必须具备3个条件： ;（一）pH梯度的建立;1.理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes）应具备的特征：;2.载体两性电解质的合成;;;3.pH梯度的形成;pH梯度形成的过程;㈠没通电时的变化 所有的载体两性电解质分子都荷电，只是溶液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电荷为零。;㈡引入电场时的变化 载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带有最低等电点的分子（荷最多的负电）将最快地向阳极迁移。当它达到净电荷是零的位置时才停止。 其次一些低pI的载体两性电解质分子（荷其次多的负电）也将向阳极移动，直到它的净电荷被减少到零才停止。;;㈢电泳结束后的变化 所有的载体两性电解质分子以增加pI级数的办法将分别在阳、阴极之间到达它们自己??位置而给出一个pI梯度。;;;电解槽中，通电后，正负两极都会发生电 极反应： 正极端反应：6H2O→O2+4H3O++4e- 负极端反应：4H2O+4e-→2H2+4OH- 在负极引起pH值的升高，在正极pH下降，另外在电极槽的正极端放的是酸性溶液，负极端放的是碱性溶液造成了在电极附近pH的急剧变化。（图a） ;pH; 由于载体两性电解质是一系列不同分子的两性电解质的混合物所组成的，设其中某一成分为A，它的pI=pH’，当环境中的pH>pH’时，它带负电荷，朝正极移动。(图b);pH; 当环境pI<pH’时，它带正电荷，朝负极移动，直至移动到它的等点电处，在那里聚集。由于两性电解质A在它的pI处具有一定的缓冲能力，因此在它附近形成一个pH稳定区域。（图c）;pH; 同样载体两性电解质中各种两性电解质也会各自迁移到它们的等电点处，由于它们的数量足够多，各自的等电点相差很小，从而形成一个pH梯度。（图d）;pH; 假设在一个系统中含有极多的有适当的等电点和它的等电点处有一定的缓冲能力的两性电解质，因此形成的pH梯度将是连续平滑的。; pH梯度的选择 在测定未知蛋白时，可先采用pH3-10的载体，经初步测定后改用较窄的以提高分辨率。;;;（二）支持介质的选择;（三）聚焦后的检测方法 ;1.各种染色法;2.扫描与定量;3.其它检测方法;蛋白质样品及分离容量 1、电聚焦有高的分辨力，一般样品不需提 纯，分析上可用来测定混合物中某一成 分的相对比例。 2、大量提纯蛋白质，则应预先初步提纯。 有些物质（如核酸）聚焦时会沉淀，应 预先除去。 3、蛋白质应不含盐，因盐浓度高电流大， 易发热，而且盐离子迁移至两极产生酸 碱，占据了分离的有效部位。;等电点聚焦的分离容量受下列几个因素影响： 1、聚焦后每一区带的蛋白量取决于密度梯 度所能支持的蛋白质，提高密度可以提 高分离容量；2、容量与区带高度的平方成正比，降低电 压可使区带变宽，提高容量，但分辨率 降低，聚焦时间长，用窄的pH梯度范围 可以使区带变宽，提高分辨率。3、分离的容量与柱的横载面成正比，用440 毫克柱时，可加粗蛋白质5克，每