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疫苗中残留物质检测 中国药品生物制品检定所 方捍华 2009年6月26日 于北京 ELISA方法类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂： 固相的抗原或抗体 酶标记的抗原或抗体 酶作用的底物 根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 夹心法 间接法 竞争法 捕获法 问 题 为什么高剂量的抗原反而在ELISA试验中经常呈现假阴性？ 为什么随着高剂量抗原浓度的不断稀释，检测结果相差甚远？ 如何避免或是否可以加以控制和消除？ 如何选择较为准确的测量值？ 两个概念－带现象/钩状效应 把抛物线顶点（拐点）左右两侧，同一反应所显示的不同性状称为双相应答（biphasic response）。 把该曲线所包括的反应区域以抗原-抗体的相对比例大致分为抗体过剩区，又称前带（prozone）。 两者浓度大致相等的当量区又称等价带。 抗原过剩区又称后带（postzone）。 钩状效应 1997年Green等根据反应曲线形状提出了钩状效应（hook effect）的名称。 前带现象系指抗体过剩时反而使反应信号弱化而使信号-剂量（浓度）曲线呈钩状的现象； 后带现象系指抗原过剩时反应信号弱化使反应信号-剂量曲线呈钩状的现象。 因此钩状效应概括了前、后带现象。 目前钩状效应多指抗原过剩而言，因此又有高剂量钩状效应（high dose hook effect）一词。 钩状效应的原因与后果，在多种原因的解释中，趋于认同的观点是： 当抗原-抗体比例适当时，形成较完整的IC网络结构，使蛋白分子的疏水结构充分暴露而易产生沉淀反应。 当两者比例失调时，将不同程度地影响IC的结构完整性，使之具有一定的溶解度或发生可逆溶解作用，即IC愈不完整，更易溶解或可逆溶解。 因此对于免疫沉淀反应而言，钩状效应是由于不能产生足够大的和溶解度低的IC。 钩状效应 对于凝集反应，则因不完整的IC网络结构经摇动而发生可逆解离。 对于各种标记免疫测定，则因形成可溶性IC或形成的IC易从固相载体上洗脱。 在一步夹心法中过量的被测物与固相蛋白及标记蛋白争相结合，难以或不能有效地形成夹心结合物。 综上，高剂量钩状效应使强阳性标本误测为弱阳性以至假阴性结果。 消除方法 在不影响所需灵敏度的前提下提高固相抗体或抗原的浓度，使拐点右移，扩展测定的先行范围。 提高固相蛋白纯度以改善其有效包被浓度。 用高亲和力的抗体进行包被，以减少不完整IC的洗脱。 在ELISA 中选择合适的标记酶和酶结合物浓度。 当包被抗体和标记抗体特异性不一时，用高特异性者进行包被为宜。 上述方法不一定完全消除钩状效应，只是某种程度上扩充测定的线性范围而已。 一步法即在加入待测物的同时加入酶结合物一起温育，一步即完成反应过程。 Ab+Ag+Ab*→Ab·Ag·Ab*+ Ab·Ag + Ag·Ab* + Ab*·Ag·Ab* (a)?? (b) (c) ?????????(d) 其中a为最后测定结果的显色源，当待测物中Ag浓度增加时，无疑 会使b、c和d复合物增加，从而消耗有限的Ab*，使a复合物相应减 少，显色降低，吸光度对抗原浓度的变化曲线成钟型曲线，而且 由于d复合物的形成，使得在同样的Ab*浓度下，一步显色较二步 法为浅。 ??? ?????? ?????????? 目前一步法所出现“钩状效应”，现已有进展，即采用包被为一种抗体，酶标记用空间距离较远的决定簇的抗体，同时在操作中充分混匀反应液，并适当延长温育时间，则可使b、c和d复合物减少到最低程度，而不出现“钩状效应”。 对于实验操作者来说，首先要了解试剂盒的方法、原理、用途和注意事项。还要对待测分析物的含量阈值范围有所估判。从而挑选出合适的检测浓度稀释度。 一般一个待测分析物要选择至少两个稀释度进行测定。并对于可疑的弱阳性和有假阴性可能的分析物进行复检。这对于实验者是发现和克服高剂量钩状效应可取的办法。 以卵清蛋白含量和牛血清白蛋白残留量ELISA为例简要说明分析物稀释度的选择和结果的确定。 卵清蛋白检测试剂盒是一步法。其标准品的范围为0.625-20.0ng/ml，因为一般流感疫苗的质量标准中对于卵清蛋白的含量要求不能超过2000ng/ml。分析物的估值与试剂盒中标准上限相差近2个数量级，故试剂盒说明书建议对分析物取原倍、10倍和100倍三个稀释度（至少两个）进行检测。 牛血清白蛋白残留量检测试剂盒是二步法。其标准品范围为2.5～40 ng/ml，因为一般疫苗质量标准中对于BSA的要求不能超过100 ng/ml。分析物的估值与试剂