ELISA试验基本步骤与材料和试剂.pdfVIP

ELISA 基本步骤和主要试剂、材料 注意：本步骤为间接 ELISA 步骤 一 主要步骤 1 包被 取所要包被的物质，提前设计好所需浓度，根据包被孔数计算所需包被物的量， 用包被液稀释至所需体积，分加至各孔中。 包被条件：两种选择：一是将 ELISA 板直接置 4℃过夜；也可以先置 37℃孵育 2 小时再转入 4 ℃过夜。 2 洗涤 包被结束后弃掉包被液，用 PBST 进行洗涤，方法为 PBST 加满每孔，静置 5-10 min ，弃掉洗液，重新加满，重复洗涤 3-5 次，最后拍干 ELISA 板等待下一步封闭。 3 封闭 常用 10%小牛血清，取第 2 步的 ELISA 板加封闭液至每孔，体积至少为所加包 被液的两倍。封闭条件也有两种选择：直接置于 4 ℃过夜，或者置于 37℃温育 2-4h， 具体何种条件不同物质的 ELISA 可能不同。 4 洗涤 封闭结束的 ELISA 板进行洗涤，方法同步骤 2。最后拍干等待加入一抗。 5 加入一抗 一抗即为你要检测的物质， 一般加之前需要稀释， 具体稀释倍数不同实验 不同需 要自己摸索。一抗样品一般用包被液稀释，稀释到所需浓度后加入到相应孔中。反应 条件为 37℃孵育 2h 。 6 洗涤 具体同步骤 4。 7 加相应 HRP-标记的商品化二抗 加相应的商品化 HRP-标记的二抗（如一抗为鼠源物质则对应加抗鼠二抗），一 般也用封闭液稀释，稀释倍数参考二抗说明书。将稀释好的二抗加入各孔， 37℃反应 1-1.5h。 8 洗涤 具体同步骤 4。 9 显色 常用 OPD 作为显色底物，但 OPD 致癌，也有用 TMB 作为底物，，这里只介绍 前者。显色需要配置显色液，具体方法为：在步骤 8 进行到一半使配置显色液，为 1 0ml 底物缓冲液加 0.015g OPD 粉末 （实际操作由于 OPD 有毒不方便称量故只需稍微 加入一点即可），等待 OPD 完全溶解。待步骤 8 完成后取 150ul 3%过氧化氢溶液加 入之前配置的 10ml 溶液中混匀，立即将此显色液分加至 ELISA 各孔中。然后将 ELI SA 板置于 37℃反应约 10min。 10 终止 将 ELISA 板取出，每孔加终止液（ 2mol/L 硫酸溶液）终止反应，立即到酶标仪 上读数（ OPD 为底物是读数波长为 490nm，TMB 为底物时波长为 450nm）。 二 材料、试剂 1 ELISA 板 专用于 EILSA 的产品称为 ELISA 板，国际上标准的微量滴定板为 8 ×12 的 96 孔 式，需要购买。常用聚苯乙烯和聚氯乙烯材料。注意：聚苯乙烯材料目前只有进口， 特点是孔大，加满约 300ul，此时实验中所加各试剂（包被液、一抗、二抗、显色液、 终止液等）均为 100ul 体积。而聚氯乙烯多为国产，孔较小，加满约 200ul，此时各 试剂只需加 50ul 体积即可。 2 各试剂配制 1）包被液（ PH6.3 的碳酸盐缓冲液） 无水 Na2CO3 0.1696g NaHCO3 0.2856g SW 100ml