蛋白抽提指南.docVIP

蛋白抽提指南(TRIZOL 在用酒精沉淀出DNA(DNA抽提中的步骤一后剩余的苯酚—乙醇上清中可以抽提出蛋白。沉淀的蛋白可通过蛋白[质]印迹法对样品中某一特殊的蛋白质进行分析。 试剂所需,但没有随同提供的物品: * 异丙醇 * 0.3M盐酸胍(用95%酒精配制 * 无水乙醇 * 1% SDS 1.蛋白质的沉淀 用异丙醇从苯酚—乙醇上清中沉淀蛋白(大约每1 ml TRIZOL试剂会剩下0.8 ml苯酚—乙醇上清液。最初匀浆化时每1 ml TRIZOL试剂加1.5 ml异丙醇。 将样品于15—30℃下放置10分钟,然后在2—8℃下以12,000×g的离心力离心10分钟。 2.蛋白质的洗涤 除去离心后的上清液并用0.3M盐酸胍(用95%酒精配制洗涤蛋白沉淀3次。 按照最初匀浆化时每1mlTRIZOL加2 ml洗涤液。在每一洗涤周期中,蛋白质和洗涤也要在15—30℃下作用20分钟然后在2—8℃下以7,500×g的离心力离心5分钟。最后的一次洗涤完成后,加2 ml无水乙醇旋涡振荡溶解蛋白沉淀,混合物在15—30℃下放置20分钟后再在2—8℃下以7,500×g 的离心力离心5分钟。 3.蛋白质沉淀的再溶解 真空干燥蛋白质沉淀5—10分钟。移液管吸取1% SDS溶解蛋白质。要完全干燥蛋白质沉淀可能要求将蛋白质样品置于50℃洪箱中干燥。对于其中的任何不溶性的沉淀物可以在2—8℃下 10,000×g