褐藻羊栖菜水通道蛋白基因SFLIP的克隆及其在淡水浸泡下的表达分析教学文案.doc

褐藻羊栖菜水通道蛋白基因SFLIP的克隆及其在淡水浸泡下的表达分析 精品文档 精品文档 收集于网络，如有侵权请联系管理员删除 收集于网络，如有侵权请联系管理员删除 精品文档 收集于网络，如有侵权请联系管理员删除 摘要 褐藻羊栖菜对淡水浸泡有很强的耐受能力，利用此特性，养殖户们用淡水浸泡的方法清除沙蚕等敌害生物，而对羊栖菜幼苗则无不良影响，而藻类独特的水通道蛋白在其中可能扮演重要角色。通过克隆得到了褐藻羊栖菜sflip基因编码序列，其包含678 bp的开放阅读框，编码225个氨基酸，sflip蛋白结构域预测表明其含有6个跨膜区域并且含有2个npa水通道特征性单元，但其中第二npa被npm取代；基因结构分析发现sflip基因含有5个内含子，与长囊水云的同源性很高；sflip基因在淡水浸泡过程中的表达先升后降，但随着时间延长则又显著上升。上述结果表明，sflip属于藻类中发现的一类新的水通道蛋白，其在羊栖菜耐受低渗胁迫中可能有种特殊的作用机制。 　　关键词 羊栖菜；水通道蛋白；基因克隆；淡水胁迫；基因表达 　　中图分类号 q943.2 文献标识码 a 文章编号 1007-5739（2016）11-0228-04 　　水通道蛋白（aquaporins，aqps）是细胞膜上选择性高效转运水分子的特异蛋白通道，属主要内在蛋白（major intrinsic proteins，mips）家族成员，除水分子外，aqps还能转运甘油、硼酸、二氧化碳、尿素和过氧化氢等多种小分子。高等植物中存在大量aqps基因，如拟南芥（arabidopsis thaliana，35个）[1]、水稻（oryza sativa，34个）[2-3]、玉米（zea mays，35个）[4]，根据亚细胞定位和转运能力的不同，主要分为pip（plasma membrane intrinsic protein）、tip（tonoplast intrinsic protein）、nip（nodulin-26 like intrinsic protein）、sip（small intrinsic proteins）和xip（x intrinsic proteins）等6类[5]。目前的研究较少关注低等植物――藻类的aqps，它们的数量明显少于高等植物，如长囊水云（ectocarpus siliculosus，3个）、三角褐指藻（phaedactylum tricornutum，5个）、假微型海链藻（thalass-iosira pseudonana，2个）等[6]。对高等植物而言，组织、器官高度分化，不同的膜、组织，甚至不同的外界条件及胁迫时间，都可能需要有不同的aqps，因此目前高等植物中发现庞大数量的aqps符合它们应对不同外界胁迫的要求；而藻类等低等植物，形态、结构和生活方式较简单，一般没有根、茎、叶的分化，它们体内aqps的数量就相对较少。另一方面，由于藻类与陆生高等植物在生长环境上存在巨大差异，藻类特别是海洋藻类中的aqps，在其应对渗透胁迫上的作用机制与高等植物也会有所区别。 　　本研究克隆得到了褐藻羊栖菜sflip基因编码序列，分析了该基因的氨基酸序列特征、基因结构及其在淡水浸泡过程中的表达模式，并预测了其蛋白结构域。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　羊栖菜采集自温州市洞头县鹿西岛。收集后，用保温箱在2 h内将海藻运回实验室。接着马上用过滤过的天然海水洗涤藻体，在用淡水处理前将其置于20 ℃装有灭菌天然海水的高密度聚丙烯箱中暂养2 d，光周期为12 h∶12 h，并向培养基中通气，同时每天更换新鲜灭菌海水。 　　1.2 羊栖菜总rna提取和cdna合成 　　样品在液氮中研磨后采用ctab法提取总rna[10]，经dnase消化去除dna，并经1%的琼脂糖凝胶电泳检测总rna的浓度和完整性。cdna合成采用roche公司cdna合成试剂盒。 　　1.3 sflip编码区序列的扩增 　　以羊栖菜cdna为模板，利用引物sflip1和sflip2（表1）扩增sflip编码区外显子全序列。pcr反应条件为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，30个循环；72 ℃再延伸5 min。将pcr产物纯化后连接到pgemt easy质粒，用热激法导入大肠杆菌dh5α，amp抗性和x-gal/iptg蓝白斑筛选并鉴定阳性克隆，送华大基因公司测序。以羊栖菜gdna为模板，利用引物sflip1和sflip2（表1）扩增sflip基因组全序列。采用neb公司超保真pcr试剂盒。将pcr产物纯化后连接到pgemt easy质粒，用热激法导入大肠杆菌dh5α，amp抗性和x-gal/iptg蓝白斑筛选并鉴定阳性克隆，送华