- 1、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。。
- 2、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
- 4、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
- 5、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 6、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 7、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
实用标准文案
RT-PCR 原理与实验步骤
一、知识背景:
1、基因表达: DNA RNA Protein
单拷贝基因表达存在逐步放大机制,如一个蚕丝心蛋白基因 10 4 个丝心蛋白
mRNA (每个 mRNA 存活 4d ,可以合成 10 5 个丝心蛋白) 共合成 10 9 个丝心蛋
白 。因此单拷贝基因的 mRNA 表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。
2 、 PCR 技术 (Polymerase chain reaction) :即聚合酶链式反应。
在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于 DNA 聚合酶的酶促反应,
其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步:
A. 变性:通过加热使 DNA 双螺旋的氢键断裂,形成单链 DNA ;
B.退火:将反应混合液冷却至某一温度,使引物与模板结合。
C.延伸:在 DNA 聚合酶和 dNTPs 及 Mg2 +存在下,退火引物沿 5 ’ 3 ’方向延
伸。
以上三步为一个循环,如此反复。
3 、逆转录酶和 RT-PCR
逆转录酶( reverse transcriptase )是存在于 RNA 病毒体内的依赖 RNA 的 DNA
聚合酶,至少具有以下三种活性:
1、依赖 RNA 的 DNA 聚合酶活性:以 RNA 为模板合成 cDNA 第一条链;
2 、Rnase 水解活性:水解 RNA:DNA 杂合体中的 RNA ;
3 、依赖 DNA 的 DNA 聚合酶活性:以第一条 DNA 链为模板合成互补的双链 cDNA.
二、 RT-PCR 的准备:
1.引物的设计及其原则:
1) 引物的特异性决定 PCR 反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至
关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列,同种蛋白的不同亚
型,不同的 mRNA 剪切方式以及可能存在的 hnRNA 对引物的特异性的影响。尽量选
择覆盖相连两个内含子的引物,或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中
不存在的内含子。
2) 引物设计原则的把握
引物设计原则包括 :
a 、引物长度 :一般为 15 ~30bp ,引物太短会影响 PCR 的特异性,引物太长 PCR 的
最适延伸温度会超过 Taq 酶的最适温度,也影响反应的特异性。
文档大全
实用标准文案
b 、碱基分布:四种碱基最好应随机分布,避免嘌呤或嘧啶的聚集存在,特别是连续出
现 3 个以上的单一碱基。 GC 含量( Tm 值): 40 %~ 60 %, PCR 扩增的复性温度一
般是较低 Tm 值减去 5 ~10 度。
c 、 3 ’ 端要求: 3 ’ 端必须与模板严格互补,不能进行任何修饰,也不能有形成任何
二级结构的可能。末位碱基是 A 时错配的引发效率最低, G、C 居中间,因此引物的
3 ’端最好选用 A 、 G、C 而尽可能避免连续出现两个以上的 T 。
d 、引物自身二级结构:引物自身不应存在互补序列,否则会自身折叠成发夹状结构或
引物自身复性。
e 、引物之间的二级结构:两引物之间不应有多于 4 个连续碱基互补, 3 ’端不应超过
2 个。
f 、同源序列:引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续 8 个的互补碱基存在。
g 、5 ’端无严格限制: 5 ’末端碱基可以游离,但最好是 G 或 C ,使 PCR 产物的
您可能关注的文档
最近下载
- 某公司完整版审批权限表.doc VIP
- 2025浙江杭州青山湖科技城投资集团有限公司下属子公司招聘11人考试模拟试题及答案解析.docx VIP
- 马自达-马自达6阿特兹-产品使用说明书-马自达6阿特兹 2.5L蓝天尊崇版-CA7250ATE4-MAZDA6ATENZA用户手册.pdf VIP
- 泡泡玛特简介.pptx VIP
- 马勒第一交响曲(钢琴版)第3乐章.pdf VIP
- 西门子断路器3WL操作手册.pdf
- 《产业园区投建营数字化平台建设指南》.pdf VIP
- 00015 《英语(二)》高频 100 题.doc VIP
- 2024年一建管理真题完整.docx VIP
- 中医面诊知识培训课件.pptx VIP
文档评论(0)