RT-PCR原理和实验步骤.pdfVIP

  1. 1、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。。
  2. 2、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载
  3. 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
  4. 4、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
  5. 5、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们
  6. 6、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
  7. 7、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
实用标准文案 RT-PCR 原理与实验步骤 一、知识背景: 1、基因表达: DNA RNA Protein 单拷贝基因表达存在逐步放大机制,如一个蚕丝心蛋白基因 10 4 个丝心蛋白 mRNA (每个 mRNA 存活 4d ,可以合成 10 5 个丝心蛋白) 共合成 10 9 个丝心蛋 白 。因此单拷贝基因的 mRNA 表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。 2 、 PCR 技术 (Polymerase chain reaction) :即聚合酶链式反应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于 DNA 聚合酶的酶促反应, 其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步: A. 变性:通过加热使 DNA 双螺旋的氢键断裂,形成单链 DNA ; B.退火:将反应混合液冷却至某一温度,使引物与模板结合。 C.延伸:在 DNA 聚合酶和 dNTPs 及 Mg2 +存在下,退火引物沿 5 ’ 3 ’方向延 伸。 以上三步为一个循环,如此反复。 3 、逆转录酶和 RT-PCR 逆转录酶( reverse transcriptase )是存在于 RNA 病毒体内的依赖 RNA 的 DNA 聚合酶,至少具有以下三种活性: 1、依赖 RNA 的 DNA 聚合酶活性:以 RNA 为模板合成 cDNA 第一条链; 2 、Rnase 水解活性:水解 RNA:DNA 杂合体中的 RNA ; 3 、依赖 DNA 的 DNA 聚合酶活性:以第一条 DNA 链为模板合成互补的双链 cDNA. 二、 RT-PCR 的准备: 1.引物的设计及其原则: 1) 引物的特异性决定 PCR 反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至 关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列,同种蛋白的不同亚 型,不同的 mRNA 剪切方式以及可能存在的 hnRNA 对引物的特异性的影响。尽量选 择覆盖相连两个内含子的引物,或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中 不存在的内含子。 2) 引物设计原则的把握 引物设计原则包括 : a 、引物长度 :一般为 15 ~30bp ,引物太短会影响 PCR 的特异性,引物太长 PCR 的 最适延伸温度会超过 Taq 酶的最适温度,也影响反应的特异性。 文档大全 实用标准文案 b 、碱基分布:四种碱基最好应随机分布,避免嘌呤或嘧啶的聚集存在,特别是连续出 现 3 个以上的单一碱基。 GC 含量( Tm 值): 40 %~ 60 %, PCR 扩增的复性温度一 般是较低 Tm 值减去 5 ~10 度。 c 、 3 ’ 端要求: 3 ’ 端必须与模板严格互补,不能进行任何修饰,也不能有形成任何 二级结构的可能。末位碱基是 A 时错配的引发效率最低, G、C 居中间,因此引物的 3 ’端最好选用 A 、 G、C 而尽可能避免连续出现两个以上的 T 。 d 、引物自身二级结构:引物自身不应存在互补序列,否则会自身折叠成发夹状结构或 引物自身复性。 e 、引物之间的二级结构:两引物之间不应有多于 4 个连续碱基互补, 3 ’端不应超过 2 个。 f 、同源序列:引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续 8 个的互补碱基存在。 g 、5 ’端无严格限制: 5 ’末端碱基可以游离,但最好是 G 或 C ,使 PCR 产物的

文档评论(0)

wanggx999 + 关注
实名认证
文档贡献者

该用户很懒,什么也没介绍

1亿VIP精品文档

相关文档