酵素连结免疫吸附法.doc

ELISA ( enzyme-linked immunosorbent assay ) 酵素連結免疫吸附法 自然界有許多專一性的配對分子，例如：兩股 DNA 分子間的鹼基配對、酵素與其基質間的結合與催化、各種荷爾蒙與其受體、抗原與其抗體的結合等。其中，抗原與抗體的專一性配對，可用人為的設計與免疫操作，在實驗室中取得專一性的抗體；這是目前極少數可用人工產生專一性分子探針的方法之一。抗體與抗原之間的高度專一性，一直吸引著研究學者的注意力；對於抗原抗體間的專一結合關係，免疫學家自百年前已從免疫沈澱法清楚觀察，後來又發展出 雙向免疫擴散 (double diffusion)，以及 酵素免疫分析法 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)，成為免疫化學的標準工具。這些免疫工具與方法，到現在都還應用在基礎研究，或產業界的各種檢驗及醫療用途上。ELISA是在1971年首次由Engvall和Perlman所介紹。不論是測抗原或抗體都有很高的敏感性及專一性，且使用設備相較之下少了許多。固相吸附准許unbound reagents快速且完全地清洗。是一種安全又穩定的方法。 酵素連結免疫分析法已日益普及，因為非常靈敏且不必如免疫螢光術和放射免疫分析法需要特殊設備。此法的原理是以一種酵素連結到抗原或抗體上，用酵素活性來做為定量標記。有許多方法已經架構完成，視使用的酵素性質及待測的抗原-抗體系統而定。其中廣泛使用的便是酵素連結免疫吸附分（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA），可以測定抗原或抗體。酵素連結免疫吸附法( enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA )的原理是依據螢光抗體方法發展出來的，它是將酵素連接到抗原或抗體分子上來偵測抗原抗體反應，最後加上酵素的受質，依其呈色強弱來表示。ELISA可以用來測抗原或抗體的量，例如要測定抗體，則將抗原連接到一固定物上，先加檢體後，再加酵素連接的免疫球蛋白，如此測得之酵素活性即代表抗體量之高低。脊椎動物對外來的異物會產生抗體來清除之，這些外來異物稱為抗原，包括細菌或者各種巨大分子；尤其蛋白質是相當強的抗原，很容易誘生出專一性抗體。 但一個抗體分子只與蛋白質分子上的一小段胺基酸鏈結合，大約在六到十來個胺基酸長度，這一小段蛋白稱 抗原決定基 (antigenic determinant 或 epitope)。因此，一個分子量較大的蛋白質，可能有數個抗原決定基，可以誘生數種不同的抗體分子，稱為多價抗原 (multivalent antigen)。而在生物體內，是由一種稱為 B 細胞的白血球負責抗體的合成；但是每一個 B 細胞只能產生一種抗體，對抗一種抗原決定基。若有一個多價抗原分子，可被宿主生物辨認出四個抗原決定基，則此宿主至少會產生四種 B 細胞，產生四種不同的抗體，分別對抗這四個抗原決定基。已知每一種 B 細胞都只能生產一種抗體，因此若能夠挑出所要的 B 細胞，大量培養後令其產生均質的抗體，就能達成上述目的。 而這種抗體因為是由單一株 B 細胞所生產，也只含有一種抗體，稱之為 單株抗體 (monoclonal antibody, mAb)。此關鍵技術是 1980 年代，單株抗體與傳統抗血清在應用上，有些不一樣的地方：(1) 單株抗體是由已經建立的融合瘤細胞所生產，因此只要細胞株存在，就可以一直生產該抗體，可以視為一種固定的試劑，不像靠動物生產的傳統抗血清，隨著動物個體不同會有變化；(2) 單株抗體因為只含有一種抗體，無法像傳統血清一樣，與抗原產生免疫沈澱，因此雙向免疫擴散也無法產生沈澱線；(3) 基於同樣的理由，加上單株抗體與抗原的結合部位通常只有一處，因此整體的結合力量可能不如傳統抗血清；(4) 但是單株抗體的專一性較好，且可控制所要對抗的抗原決定基位置。近年來也因此流行一種方法，先選擇目標蛋白質上具有較強抗原性的一個片段，大約有十到二十個胺基酸的長度，再以人工方法合成出這條胜汰後，接到無關的巨分子蛋白質 carrier，然後免疫動物產生傳統的抗血清。這種抗血清因為只會對抗一段很短的蛋白質片段，有點類似單株抗體對抗抗原決定基的高度專一性，特稱之為 單專一性抗體 (monospecific Ab)。另外，當基因操作技術發達之後，發展出 噬菌體表現 (phage display) 的方法，期以取代傳統的細胞融合方法，以便得到類似單株抗體的專一性探針。這是利用噬菌體的外殼蛋白基因為架構，插入抗體基因上與抗原結合區的部份 (variable regions 或 domains)，然後利用基因洗牌方式任意修改這段基因，建立一個噬菌體基因庫並由其中篩選，找出可以表現對抗原具有高專一性結合的噬