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神经病学专业毕业论文 [精品论文] RelB基因沉默DC对实验性重症肌无力的治疗作用及免疫调节机制研究 关键词：重症肌无力 RelB基因 树突状细胞 治疗作用 免疫调节 RNA干扰 摘要：第一部分 小鼠RelB基因RNA干扰慢病毒载体的构建及对树突状细胞成熟活化的影响 目的：构建小鼠RelB基因RNA干扰慢病毒表达载体，探讨其对小鼠骨髓源性树突状细胞RelB表达及成熟活化的影响 方法：根据Genebank RelB基因信息，设计了4个小干扰序列和1个阴性对照序列，利用慢病毒载体pGCSIL构建了5个重组质粒并进行了慢病毒包装，分别为LV-SiRelBl，LV-SiRelB2，LV-SiRelB3，LV-SiRelB4，LV-SiNC：感染工具细胞NIH3T3细胞后，荧光定量PCR检测干扰效率，选择干扰效率最高的载体进行慢病毒大量包装。用筛选出的含有效靶点的慢病毒和阴性对照病毒感染小鼠骨髓树突状细胞（BMDC），并给予LPS刺激，相应的DC命名为RelB-Silenced DC和Control DC；用荧光定量PCR和Western blot检测干扰效率，流式细胞仪检测表面分子CD86、CD80、MHCII，ELISA检测培养上清IL-6，IL-12，IL-23。 结果：测序结果证明5种质粒载体的插入序列正确，鉴定证明慢病毒包装成功。慢病毒感染NIH3T3细胞后，荧光定量PCR证实重组慢病毒LV-SiRelB3的干扰效率最高，对RelB mRNA表达的抑制达82％。荧光定量PCR和Western blot证实LV-SiRelB3感染BMDC可有效抑制DC中RelB mRNA和蛋白表达，抑制率分别达78.8％，75.2％。流式细胞仪和ELISA检测证实，与Control DC相比，RelB-Silenced DC CD86、CD80、MHCII表达及IL-6，IL-12，IL-23分泌水平显著降低。 结论：成功构建RelB RNAi重组慢病毒质粒LV-SiRelB3，它能有效抑制小鼠骨髓源性树突状细胞RelB表达及成熟活化，为进一步研究RelB基因沉默DC用于自身免疫性疾病治疗奠定了基础。 第二部分 RelB基因沉默DC对实验性重症肌无力的治疗作用及免疫调节机制 目的：探讨RelB基因沉默DC对实验性自身免疫性实验性重症肌无力的治疗作用及相关免疫调节机制。 方法：①RelB基因沉默DC或对照DC与AChR反应性CD4+T细胞共培养，并分别给予T-AChR、Tα146-162肽段、对照抗原OVA刺激，并设立无抗原刺激共培养体系为阴性对照。3H-TdR掺入法检测CD4+T细胞增殖能力。②RelB基因沉默DC或对照DC与AChR反应性CD4+T细胞共培养，并分别给予T-AChR、Tα146-162肽段刺激，收集培养上清用ELISA检测IL-17，IFN-Y，IL-4，IL-10水平。③以第0，30，60天皮下注射（T-AChR+CFA）抗原乳剂免疫C57BL/6小鼠的方法诱导EAMG动物模型。距初次免疫70天选取EAMG临床评分达1-2分的C57BL/6小鼠随机分为治疗组和治疗对照组，每组12只。治疗组于入组后0，7，14天静脉注射负载Tα146-162的RelB-Silenced DC，治疗对照组于入组后0，7，14天静脉注射等量负载Tα146-162的Control DC。④入组后第20天，取静脉血用ELISA方法检测抗AChR IgG，IgG1，IgG2b，IgG2c滴度。⑤入组后第21天处死小鼠，取脾细胞用3H-TdR掺入法检测淋巴细胞增殖反应，ELISA检测IL-17，IFN-Y，IL-4，IL-10水平，Western blot检测Th17，Th1，Th2，Treg细胞相应特异转录因子RORγ t，T-bet，GATA-3，FoxP3表达水平。 结果：①在无抗原及对照抗原OVA存在时，AChR反应性CD4+T细胞呈现低增殖反应；在T-AChR及Tα146-162存在时，AChR反应性CD4+T细胞呈现高增殖反应；与对照DC共培养体系相比，RelB基因沉默DC共培养体系CD4+T细胞增殖反应显著降低。②与对照DC共培养体系相比，RelB基因沉默DC与AChR反应性CD4+T共培养后，培养上清IL-17、IFN-γ水平显著降低，而IL-4，IL-10水平显著增高。③与对照DC治疗组相比，RelB基因沉默DC治疗组小鼠平均临床评分显著降低，血清抗AChR IgG，IgG1，IgG2b滴度显著减低。④与对照DC治疗组相比，RelB基因沉默DC治疗组脾淋巴细胞增值反应显著降低，Th17细胞标志物（IL-17，RORγ t）和Thl细胞标志物（IFN-γ，T-bet）显著减低，Th2细胞标志