动物细胞培养常用方法.docx

细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle ）概念 细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要 是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指 细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖 周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即Gi期（DNA合成前期）， S期（DNA合成期），G2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以Gi 期为起点，那么细胞增殖周期的各时期应循着 Gi-S-G 2-M的顺序进行，Gi、S、 G2三期合称为细胞问期，此期完成细胞生长过程。 M期完成遗传物质的分配。 因此，细胞增殖周期=问期（Gi期+S期+G2期）+分裂期（M期）。 培养细胞生命期（life span of culture cells ） 很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。 索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。 培养细胞的生 命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维 细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传 30~50代，相当丁 i50~300个细胞 初代J吝养 初代 J吝养.胞系 0 8 6 all指数加胞数卜 0 8 6 all 指数加胞数卜 传代期 '—? 感谢下载载 转化 ——? TOC \o "1-5" \h \z 第 / 接 一 神次 传代间隔 / 培传 / 芥代 / \o "Current Document" 0 2 4 6 8 10 12 14 16 图2-4培养细胞的生命期 增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个 体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代 或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存 期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何， 在细 胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。 培养细胞一代生存期 培养细胞的生存空间和营养是有限的， 当细胞增殖达到一定密度后，则需要 分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代 (Passage或Subculture )。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定 的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、 接种细胞的数量和细胞增殖的速度 等有关。接种细胞数量大，细胞基数大。相同增殖速度条件下，细胞数量增加与 饱和速度相对要快(实际上细胞接种数量大时细胞增殖速度比稀少时要快) ；连 续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增值快；；培养液中血活含量多时细胞增 殖比少时快。以上情况都会缩短传代时间。 所谓细胞“一代” 一词，仅指从细胞接种到分离培养时的一段时间，这已成 细胞增袍率极限点平顶期指敖增牛堪潜蹴:依 *:? 细胞增袍率极限点 平顶期 指敖增牛堪 潜 蹴:依 *:?期 仁期 ■ 抱 增 生 数 ■ ■ . . 此 =_—_———— 旦 一 E 5_^^一 0 24 4X 72 % 120 时 为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞时代或倍增非同意含义。如某一细胞系 为第20代细胞，即指该细胞系已传代 20次。在细胞一代中，细胞能倍增 3~6 次。细胞传一代后，一般要经过以下六个阶段：游离期、贴壁期、潜伏期、指数 增长期、停滞期、衰退期。 无菌操作要求 （一） 实验前培养室和超净台的消蠹。在工作台面消蠹时，切勿将培养细胞和 培养用液用紫外线照射；工作台面上的用品不要过多或重叠放置， 否则会遮挡射 线，降低消蠹效果；一些操作用具，如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用 75%洒精擦拭后置台内同时紫外线照射消蠹。 （二） 无菌操作工作区域应保持活洁与宽敞，必要物品，如试管架、移液器或 吸管头等可以暂时放置，其他实验用品用完后应及时移出，以利气体流通。试剂 瓶口和外壁要用75 %洒精擦拭后才能带人无菌操作台内。超净台上的物品布局 要合理，污物废液缸、洒精棉球缸在右侧位，洒精灯在中央区，试剂瓶在左侧位。 实验操作应在操作台中央无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。 （三） 洗手和着装：严格按照外科手术要求消蠹着装，双手用肥皂洗净后，浸 泡于消蠹液中，并用75%的洒精擦拭。 （四） 操作中，小心取出无菌实验用品，避免造成污染。尽量减少手与器材的 接触面，学会手指操作。手指不能触及器材使用端及容器瓶口，如触及，需要更 换或烧灼后再使用。组织、细胞及培养板在未做处理和使用前， 不要过早暴露于 空气中。 （五） 一切操作，如打开或封闭瓶口，安装吸管、注射器等，都要在洒精灯火 焰前方进行。瓶口、吸管、注射器等使用前要经过火焰烧灼