PK法提全血DNA步骤.docVIP

PK法提全血DNA（蛋白酶K法） 一、试验原理：苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA 的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/10 3mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。 二、步骤： 1、1ml EDTA－Na2抗凝血于10ml离心管中，加3体积1×RBC裂解液混匀，冰浴30min. 2、4度10000 rpm离心10min,弃上清，加入1ml 1×细胞核裂解液（混匀，把沉淀摇起来），再加2ml 1×细胞核裂解液和150μl 20%SDS摇匀，直至出现粘稠透明状，加20μl 16mg/mlPK,摇匀，37度消化6h以上或者过夜（摇床