生物制药工艺学第9章亲和纯化技术08 04 16.ppt

63 （一）、金属螯合亲和层析 ? 将环氧活化型 Sepharose 6B 与金属螯合剂 偶联，再用金属离子溶液处理制成金属螯合 亲和层析柱。 ? 金属螯合剂 : 亚氨二醋酸、氨基水杨酸、 8- 羟 基喹啉、羧甲基氨基酸等 . 64 ? 蛋白质上的氨基酸残基，如 组氨酸的咪 唑基 、 半胱氨酸的巯基 和 色氨酸的吲哚 基 ，利于蛋白质与固定化金属离子结合。 ? 金属离子如 锌和铜 。 65 ? 吸附： pH 在 6~8 。 ? 洗脱：降低 pH 值、增加离子强度、或在缓冲 液中加 5mmol/L EDTA 等方法。 特点： ? 蛋白质 吸附容量 大； ? 价格便宜； ? 具有普遍适用性。 31 双功能试剂法 ? 双功能试剂 是同一分子中具有 两个反应活性基团 的 化学试剂，常作为连接两个分子的“桥梁”。 ? 二乙烯砜、戊二醛、琥珀酸酐 ? 优点：反应速度快、条件温和，能与氨基、糖类、 酚、醇类等偶联。 ? 32 （二）、聚丙烯酰胺凝胶及 其它凝胶衍生物活化与偶联 ? 叠氮化法 ? 重氮化法 ( 含氨基载体 ) ? 碳二亚胺缩合法（含羧基载体） 33 聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法 ? 有大量可修饰的 酰胺基 。 ? 酰胺基能被 含氮化合物 置换制备多种衍生物。 34 叠氮化法 ? 聚丙烯酰胺的 酰肼衍生物 ，加 1mol/L 的亚硝酸， 反应液搅 90s ； ? 加入 脂肪胺类配基 ，制得亲和吸附剂。 35 重氮化法 ? ω - 氨基烷基琼脂糖衍生物，对硝基苯甲酰氯反应，制得 对硝基苯甲酰胺烷基琼脂糖衍生物 。 ? 用连二亚硫酸钠还原，亚硝酸钠处理，得 重氮盐衍生物 。 ? 配基与重氮盐衍生物偶联 ，制得亲和层析柱。 36 碳二亚胺缩合法 ? 碳 二 亚 胺 为 羧 基 活 化 剂 。 ? 反 应 中 的 脲 衍 生 物 可 用 有 机 溶 剂 洗 涤除去。 37 （三）、用于固定化配基的凝胶衍生物 1 、 CNBr 活化的 Sepharose 4B ? Sepharose 4B 经 CNBr 活化，可偶联蛋白和核 酸类配基。 2 、 AH-Sepharose 4B 和 CH-Sepharose 4B 含有 6 个碳原子的”手臂”的琼脂糖衍生物 ? AH-Sepharose 4B 用于含有羧基的一类配基 。 ? CH-Sepharose 4B 能与含有一级氨基的配基偶 联。 38 ? 39 3 、环氧活化型 Sepharose 6B ? 由亲水 “手臂” 与 Sepharose 6B 载体通 过醚链形成的衍生物。 ? 用于 小分子配基的固定化 。 ? 用于偶联脂多糖、蛋白等大分子配基。 40 4 、活化型亲和胶 10 和 15 ? 由 N- 羟琥珀酰亚胺 与琼脂糖衍生物形成的活化酯。 ? Affi-Gel10 的“手臂”长为 10 个碳原子，产生一些负电 荷， 有利于碱性或中性蛋白偶联 ； ? Affi-Gel15 为 15 个碳原子的“手臂”，产生一些正电荷， 故 有利于酸性蛋白的偶联 。 41 5 、 CM- 生物胶 A 、亲和胶 202 和亲和胶 102 ? CM Bio-Gel A ，无“手臂” 的 羧基衍生物 ； ? Affi-Gel 102 具有 6 个原子“手臂”，未端为氨基。 ? Affi-Gel202 具有 10 个原子的 “手臂 ”，未端具有羧基； 42 五、 影响吸附亲和力的几个因素 ? K L ? 配基浓度 对亲和力的影响 ? 空间障碍 的影响 ? 配基与载体的 结合位点 的影响 ? 载体孔径 的影响 ? 微环境 的影响 43 （一）、配基浓度对亲和力的影响 ? 为将亲和配体与其它物质分开，需要 阻留值 ≥ 10 。 ? 配基浓度 与 亲和对解离常数 相关。 ? 对于低亲和力系统， 配基浓度 。 44 （二）、空间障碍的影响 ? 空间位阻。 ? 对于 分子大的配体 以及 小 分子配基 更明显。 ? “手臂” ，增加与载体相 连配基的活动度，减轻载 体的立体障碍。 ? 常用的“手臂”多为烃链 。 45 （三）、配基与载体的结合位点的影响 ? 多肽或蛋白质等大分子配基 ? 须 控制偶联 反应 条件 ，使它以 最少的功能基团 与载体连接 。