cdna文库构建策略及其分析研究进展.pdf

　自 20 世纪 70 年代中期首例 cDNA 克隆问世以来，构建 cDNA 文库已成为研究功 能基因 学的基本手段之一。cDNA 便于克隆和大量表达，它不像基因组含有内含子而 难于表达，因此可以从 cDNA 文库中筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的 表达。通过构建 cDNA 表达文库不仅可保护濒危珍惜生物资源，而且可以提供构建分子 标记连锁图谱的所用探针，更重要的是可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究。因此， cDNA 在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特 殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命 现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。 　　从 1976 年 HOFSTETTER 成功的构建了第一个 cDNA 文库以来，构建 cDNA 文库的技术方法经历了一个逐步发展完善的过程。初期 cDNA 文库，由于当时技术的限 制，选用质粒载体存在着连接效率低、难以扩增和保存等缺点，而 YOUNG 和 DAVIS 重 载体为表达性文库构建和保存提供了质的飞跃。近年来，cDNA 文库构建 的新方法层出不穷，但其共同目的是使 cDNA 文库更加迅速、高效满足研究的需要。本 文就近年来发展的 cDNA 文库的构建及其类型特点作一简要综述。 1 cDNA 文库的构建 1.1 cDNA 文库构建的基本原理与方法 　　cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典 cDNA 文库构建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头， 连接到适当的载体中获得文库。其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸 胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定) ，要构建一个高 质量的 cDNA 文库，获得高质量的 mRNA 是至关重要的，所以处理 mRNA 样品 时必须仔细小心。由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环 境，因此建立一个无 RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。在获得高质量的 mRNA 后，用反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第 1 链， cDNA 第 2 链的 合成(用 RNA 酶 H 和大肠杆菌 DNA 聚合酶 I ，同时包括使用 T4 噬菌体多 核苷酸酶和大肠杆菌 DNA 连接酶进行的修复反应) ，合成接头的加入、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插入片断，扩增 cDNA 文库、对建立的 cDNA 文 库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择，常规用的是 λ 噬菌体，这是因为 λ DNA 两端具有由 12 个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源 DNA 。 1.2 cDNA 全长文库 　　经典 cDNA 文库的构建虽然高效、简便，但文库克隆的片段一般较小，单个克隆上 的 DNA 片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要几个克隆才能覆盖一个完整的 全基因的 cDNA 。为了克隆到真正的 cDNA 全长，建立富含全长的 cDNA 文库具 有重要意义。为此，必须克服仅用 mRNA