实验四 蛋白质定量测定方法.pptVIP

实验蛋白质的定量测定方法 【实验预习】 试比较Foin酚法与考马斯亮蓝染料结合比色法 的优缺点。 2.试比较二喹啉甲酸法与Foin酚法的优缺点 3.凯氏定氮法中在消化样品时,加入浓硫酸,硫 酸钾和硫酸铜粉末的目的是什麽 4.紫外吸收法测定蛋白质含量的原理是什麽?  Foin酚试剂法( Lowry法) 【实验目的】 学习Foin酚试剂法测定蛋白质含量的原理 掌握Foin酚试剂法测定蛋白质含量的方法和操作。 【实验原理】 蛋白质中含有酪氨酸和色氨酸残基,能与 Folin酚试剂起氧化还 原反应。反应过程分为两步,第一步:在碱性溶液中,蛋白质分子 中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2作用生成蛋白质Cu2+复合物:第 步:蛋白质Cu2复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中 的磷钼酸和磷钨酸,生成蓝色的化合物。  工【实验原理】 该呈色反应在30分钟内即接近极限,并且在一定浓度 范围内,蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系,故可用 比色的方法确定蛋白质的含量。进行测定时要根据蛋白质 浓度的不同选用不同的测定波长:若蛋白质含量高时 (25100μg)在500nm波长处进行测定,含量低时(525μg 在755nm波长处进行测定。最后根据预先绘制的标准曲线 求出未知样品中蛋白质的含量。 Foin酚试剂法操作简便,灵敏度高,样品中蛋白质含 量高于5μg即可测得,是测定蛋白质含量应用得最广泛的方 法之  【实验材料】 1实验器材 100毫升容量瓶2只;移液管1毫升4支,5毫升2支;分光光度计。 2.实验试剂 (1)Fo1in酚试剂甲:将lg碳酸钠溶于50m0.lmo丨/L氢氧化钠溶液中 再把0.5g硫酸铜(oυS04·5Ho溶于100mlL1%酒石酸钾(或酒石酸钠)溶液, 然后将前者50mL与后者lmL混合。混合后1日内使用有效 2) Fol in酚试剂乙:在1.5L容积的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠 (Na2WO42H20)、25g钼酸钠(Na,Mo04·2H20)、700m蒸馏水、50mL85%磷酸 及100m浓盐酸,充分混匀后回流ⅰh。回流完毕,再加150g硫酸锂、50mL 蒸馏水及数滴液体溴,开口继续沸腾15分钟,以便驱除过量的溴,冷却后 定容到1000。过滤,如显绿色,可加溴水数滴使氧化至溶液呈淡黄色 置于棕色瓶中暗处保存  「【实验材料】 使用前用标准氢氧化钠溶液滴定,酚酞为指示剂,以标定该试 剂的酸度,一般为2mo/L左右(由于滤液为浅黄色,滴定时滤 液需稀释100倍,以免影响滴定终点的观察)。使用时适当稀释 (约1倍),使最后浓度为lmo丨/L酸。 (3标准蛋白质溶液:用分析天平精密称取牛(或人)血清白蛋 白100毫克,用少量蒸馏水完全溶解后,转移至100毫升容量瓶 中,准确稀释至刻度,使蛋白质浓度1mg/mL。 (4)样品溶液:配制约0.5mg/mL的酪蛋白溶液作为未知样品 溶液。