脲酶地测定方法.pdf

一、脲酶测定 ( 比色法 ) 脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源， 它的活性可以用来表示土壤供氮能力。 1、试剂配制： （1） pH6.7 柠檬酸盐溶液： 取 368g 柠檬酸溶于 600mL蒸馏水中， 另取 295g 氢氧化钾溶于水， 再将两种溶液合并， 用 1N氢氧化钠将 pH调至 6.7 ， 并用水稀释至 2L 。 （2） 苯酚钠溶液：称取 62.5g 苯酚溶于少量乙醇中，加 2mL甲醇和 18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至 100mL（A 液），保存再冰箱中。称取 27g 氢氧 化钠溶于 100mL水中（ B 液），保存于冰箱中。使用前，取 A、B 两液 各 20mL混和，并用蒸馏水稀释至 100mL备用。 （3） 次氯酸钠溶液： 用水稀释制剂至活性氯的浓度为 0.9 ％，（1.9g 次氯酸 钠溶于 1L 水中）溶液稳定。 （4） 10％尿素溶液： 10g 尿素溶于 100mL水中。 （5） N 的标准溶液：精确称取 0.4717g 硫酸铵溶于水稀释至 1L，则得 1mL 含 0.1mgN的标液，再将此液稀释 10 倍制成氮工作液（ 0.01mg/mL）。 2、操作步骤 称取 5 ｇ土置于 50mL容量瓶中 , 加 1mL 甲苯处理 , 加塞塞紧轻摇 15ｍｉｎ ; 往瓶中加入 5mL10%尿素液和 10mL的柠檬酸盐缓冲液 ( ｐＨ6.7), 仔细混匀。在 37℃ 恒温箱中培养 24 ｈ。然后用热至 38℃的蒸馏水稀释至刻度 ( 甲苯应浮在刻度以 上 ), 摇荡 , 将悬液过滤。取滤液 1mL置于 50mL容量瓶中 , 用蒸馏水稀释至 10mL, 然后加入 4mL苯酚钠溶液 , 并立即加入 3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后 , 立即 将混合物摇匀 ,20 ｍｉｎ后 , 将混合物稀释至刻度 , 在波长 578 ｎｍ处测定吸光值。 脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差 , 根据标准曲线求出氨态 氮量。 标准曲线绘制 ：分别取 0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于 50mL容量瓶 中，加蒸馏水至 20mL，再加 4mL苯酚钠溶液和 3mL次氯酸钠溶液， 随加随摇匀， 20min 后显色，定容。 1h 内再分光光度计上于 578nm处比色。 3、结果计算 以 24 小时后 1g 土壤中 NH3 －N 的质量（ mg）表示脲酶活性（ Ure） Ure＝a ·V ·n/m 式中： a 为由标准曲线求得的 NH3 －N浓度（ mg/mL）；V 为显色液体积（ 50mL）；n 为分取倍数； m为烘干土重（ g ）。 补充： 1) 1h 内在（（青定）酚的蓝色在 1h 内保持稳定）在分光光度计上用 1cm液槽， 于 578nm处将显色液进行比色测定。 2) 无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。以检验试剂纯度，整个实 验设置一个对照 3) 无基质对照： 以等体积的水代替基质， 其他操作与样品实验相同。 每个土样都 设此对照。 过氧化氢酶测定 ( 容量法 ) 过氧化氢酶也叫接触酶， 能促进过氧化氢对各种化合物的氧化。