酶联免疫吸附实验ELISA--操作规则(新手适用).pdf

实用标准文案 酶联免疫吸附实验 ELISA －－操作规则（新手适用） 一、实验目的 酶联免疫吸附测定 (enzyme-linked immunosorbent assay 简称 ELISA) 是在免疫酶技术 (immunoenzymatic techniques) 的基础上发展起来的一种新 型的免疫测定技术， ELISA过程包括抗原 ( 抗体 ) 吸附在固相载体上称为包被， 加待测抗体 ( 抗原 ) ，再加相应酶标记抗体 ( 抗原 ) ，生成抗原 ( 抗体 )-- 待测抗体 ( 抗原 )-- 酶标记抗体的复合物， 再与该酶的底物反应生成有色产物。 借助分光 光度计的光吸收计算抗体 ( 抗原 ) 的量。待测抗体 ( 抗原 ) 的定量与有色产生成正 比。 二、实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多， 如过氧化物酶， 碱性磷酸酯酶， β－Ｄ－半 乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶， 6 －磷酸葡萄糖脱氧酶 等。常用于 ELISA法的酶有辣根过氧化物酶， 碱性磷酸酯酶等， 其中尤以辣根 过氧化物酶为多。 由于酶摧化的是氧化还原反应， 在呈色后须立刻测定， 否则 空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。 辣根过氧化物酶（ HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素 (protonhemin) 区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素 辅基的最大吸收峰是 403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是 275nm，所以酶的浓 度和纯度计算式是（已知 HRP的 A(1cm 403nm 1%)＝25，式中 1％指 HRP百分 浓度为 100ml 含酶蛋白 1g，即 10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是 HRP 的 A(1cm 403nmmg/ml=2.5)HRP纯度 (RZ)=A403nm/A275nm纯度 RZ （Ｒeinheit Zahl ）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度 HRP的 RZ值在 3.0 左右，最高 可达 3.4 。用于 ELISA检测的 HRP的 RZ值要求在 3.0 以上。 精彩文档 实用标准文案 （二）酶与底物 酶结合物是酶与抗体或抗原 , 半抗原在交联剂作用下联结的产物。是 ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反 应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。 免疫技术常用的酶及其底物 酶 底物 显色反应 测定波长 邻苯二胺 橘红色 492* 四甲替联苯胺 黄色 460** 氨基水杨酸 棕色 449 辣根过氧化物酶 邻联苯甲胺 兰色 425 2 ，2- 连胺基 -2(3- 乙 蓝绿色