组织裂解液和细胞裂解液的配制.pdfVIP

组织裂解液和细胞裂解液如何配制? 一、细胞裂解液配制 方法一 一、试剂准备 1、新鲜配制冷的 RIPA 裂解缓冲液: 150 mM NaCL 1% NP-40 (去垢剂) 0.1% SDS (去垢剂) 2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入) 2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入) 1 mM PMSF (蛋白酶抑制剂) 1.5 mM EDTA (蛋白酶抑制剂) 1mM NaVanadate (磷酸脂酶抑制剂)(任选) 以上所有试剂均按比例溶于 150 mM NaCL 溶液中。 2、冷的 PBS 中加入 1 mM PMSF 1.5 mM EDTA 1mM NaVanadate （钒 钠）(任选) 3、对数期生长状态佳的细胞，75cm 至少 3-4 瓶（90%以上生长面积）。 二、实验步骤 1、将长满细胞的培养瓶放置在冰上， 用吸液管吸出培养液。加入足够 的冷的 PBS 在培养瓶中充分洗涤细胞表面，以洗去瓶中残留的培养 基，倒掉 PBS ，重复以上操作 2-3 遍。在最后一次洗涤中尽可能吸干 残留的 PBS，尽量在冰上操作。 2、 向培养瓶中加入冷的 RIPA 裂解缓冲液 (每 75cm2 培养瓶加 1ml). 然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞，如果所需要刮的同种细 胞有多瓶，则将第一瓶刮下的细胞液吸出转入下一瓶中继续刮 ( 由于 处理后的细胞裂解液较粘稠，所以宜用直径大点的吸液管吸取)。 3、 吸出刮好的细胞裂解液置于 14ml 离心管中 （置于冰上），然后重 复步骤 2 以刮取剩下的细胞。 4、尽可能将多的细胞裂解液收集到 14ml 的离心管中，样品插入冰盒 行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次 2-3 秒，重复 3-4 次。 如仍有细胞碎片或沉淀，应离心 10000rpm,10 分钟，留取上清。 5、 取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度（用 Biorad Bradford 试剂盒或 紫外分光光度计，在 A280 测定），分装保存在 -70℃。 4 方法二 NP-40 or Triton-100 1% TrisHCl (pH 8.0) 50mmol/L NaCl 150mmol/L PMSF （苯甲基磺酰氟） 0.1mmol/L(100µg/ml) Pepstatin( 胃蛋白酶抑制剂) 1 µmol/L(0.7µg/ml) Leupeptin （亮抑制肽） 0.5mg/ml Aprotinin （抑蛋白酶肽） 0.3µmol/L(1µg/ml) （注：PMSF 贮存液：100mmol/L 即 17.4mg/ml 于异丙醇中； Aprotinin 贮存液：10mg/ml 溶于 0.01mol/LHEPES(pH8.0); Leupeptin 贮存液：10mg/ml 溶于水中； Pepstatin 贮存液 10mg/ml 于甲醇液中.均于-20℃保存） 裂解操作程序： 7 * 离心收集 1×10 个细胞 * 加入 4℃预冷 1%NP-40 裂解液 100µl * 剧烈震荡使细胞充分悬浮混匀（如为组织 行匀浆） * 4℃放置 15~30min * 4℃离心，15 000rpm,10min，取上清备用。 方法三 细胞裂解液的主要目的：1.利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂 细胞；2. 溶解蛋白；3. 蛋白变性使其稳定；4. 抑制蛋白酶活性 推荐 RIPA buffer: . 50 mM Tris-HCl pH 7.4 缓冲体系 · 150 mM NaCl 等渗体系 · 1 mM PMSF 强大的蛋白酶抑制剂 · 1 mM EDTA 变性剂和稳定剂 · 5 µg/ml Aprotinin （抑肽酶）蛋白酶抑制剂 · 5 µg/ml Leupeptin 蛋白酶抑制剂 · 1% Triton x-100 破坏细胞 ·1% Sodium deoxycholate 中度变性剂和蛋白溶解剂 细胞裂解液的主要目的：1.利用去污剂破坏脂质双分子