第五章亲和层析2教程教案.pptVIP

第五章 亲和层析分离技术;第一节　亲和层析概述;历史;第二节　亲和层析基本原理及理论基础;亲和力 ; ?固相化 ? (Immobilise) ? 配体Ligand:亲和层析中能被某一生物大分子识别和可逆结合的生物专一性物质。即被固定在基质上的分子称为配体。 基质Matrix(载体):亲和层析中与配体共价结合,使其固相化的物质。;?吸附 ?(Adsorption) ? ?解吸 (Elution );一、亲和层析基本原理;;分离过程;二、亲和层析的特点;与其他层析技术比较;三、亲和层析的类型;生物亲和层析 ;免疫亲??层析 ;固定化金属离子亲和层析 ;固定化金属离子亲和层析 ;拟生物亲和层析 ;四、亲和层析载体;（二）常用载体 ;1. 纤维素 ;2. 琼脂糖凝胶 ;3. 聚丙烯酰胺凝胶 ;4. 葡聚糖凝胶 ;5. 多孔玻璃珠(商品为Bio-Glass) ;载体;五、亲和配体 ;（二）配体的浓度 （三）配体偶联的位置 （四）配体分子的大小 （五）配体的类型 ;配体的浓度 ;配体偶联的位置 ;配体分子的大小 ;配体的类型 ;第三节　亲和层析的操作过程;溴化氰活化 ;聚丙烯酰胺的活化 ;二、间隔臂分子（手臂）;三、配体偶联的方法 ;碳二亚胺缩合法 ;酸酐法 ;叠氮化法 ;重氮化法 ;四、用于固定化配体的凝胶衍生物;五、影响吸附剂亲和力的几个因素;（一）微环境的影响 ;（二）空间障碍的影响 ;（三）配基浓度对亲和力的影响 ;（四）配体与载体的结合位点的影响 ;（五）载体（基质）孔径的影响;六、亲和层析的基本操作 ;（一）上样;（二）洗脱;（三）亲和吸附剂的再生和保存 ;第四节 亲和层析的应用;Figure 1. Loading affinity column.;Figure 2. Proteins sieve through matrix of affinity beads.;Figure 3. Proteins interact with affinity ligand with some binding loosely and others tightly. ;Figure 4. Wash off proteins that do not bind. ;Figure 5. Wash off proteins that bind loosely.;Figure 6. Elute proteins that bind tightly to ligand and collect purified protein of interest.;亲和层析法分离豌豆凝集素;[原理] 亲和层析技术利用豌豆凝集素可与葡聚糖凝胶发生特异性结合，再用含葡萄糖的氯化钠溶液将豌豆凝集素洗脱下来。比较豌豆凝集素和杂蛋白对兔红细胞凝集作用的差异来进行鉴定。 ;[器材] 1.层析柱 2.恒温孵育箱 3.反应板 ;[试剂] 1.1mol/L NaCl洗脱液 2.0.2mol/L葡萄糖NaCl洗脱液 3.Sephadex G-50 4.兔红细胞悬液 5.样品液 ：杂蛋白和凝集素;[操作];2.豌豆素生物活性测定 取反应板一块，分别在各孔中加入对照生理盐水、杂蛋白洗脱液、豌豆凝集素收集液各二滴再加入兔红细胞悬液1滴，置37℃保温10分钟，取出后用玻棒在反应孔轻轻搅动，比较各孔凝集情况，并解释结果。 ;思考题