质粒DNA提取和PCR技术.pptVIP

质粒DNA的提取和 PCR技术 质粒提取 ◆基本原理 ◆操作步骤 多÷注意事项 心实验室安全 ◆基本原理 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA,大小范围从1kb至 200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独 立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份.质粒已 成为目前最常用的基因克隆的载体分子,碱裂解法是 最常用的方法。 基本原理为:当菌体在NaOH和sDs溶液中裂解时,蛋 白质与线性DN发生变性,质粒释放到上清中。当加 入中和液后,因为闭环的质粒DNA分子虽然氢键破坏 但双链并不分离。能够迅速复性,呈溶解状态,离心 时留在上清中;蛋白质与染色体DNA变性相互缠绕成 大分子复合物而呈絮状被SDs覆盖,当加入溶液三后 形成PDS被离心时可沉淀下来 试剂准备 ◆1.溶液I:50mM葡萄糖平衡渗透压,调节F值,有利悬浮 25 mM Tris-HCI(pH8.0)调节P值 10 mM EDTA(pH8.0)鏊和离子抑制DNas活性 高压灭菌15min,贮存于4℃ 2.溶液Ⅱ:0.2 N NaOH,1%SDS裂解细菌,变性线性DNA ·3.溶液Ⅲ:醋酸钾(KAc)3M,p148中和值,并与SDs ◆4.苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)苯酚变性抽提蛋白,为 tris-base平衡酚。氯仿防止苤酚与水互溶。异戊醇的作用是降 低表面张力,可以减少泡沙 5.异丙醇,乙醇(无水乙醇、70%