实时定量PCR (2)教材课程.pptVIP

实时定量PCR（qRT-PCR）;Polymerase Chain Reaction（PCR）　聚合酶链式反应;Kary B. Mullis;PCR的基本原理;50-65℃;PCR的基本原理;;;;PCR基本原理;; 1、单、双链DNA，cDNA均可 2、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂DNA结合蛋白类 3、一般100ng DNA模板/100?L,模板浓度过高会导致反应的非特异性增加; 1、引物浓度一般为0.1-0.5 ?mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降 2、引物的设计 ;（3）Taq DNA聚合酶;（4）Mg2+; 1、dNTP浓度取决于扩增片段的长度 2、四种dNTP浓度应相等 3、浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 4、dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。;变性 使双链DNA解链为单链,94℃ 30-40s 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 ;循环参数;常用PCR反应体系 (以HiFi Taq为例);常用PCR反应条件;几种常用PCR技术;基因;RT-PCR基本原理;RT-PCR一般步骤;2、反