2019年淀粉酶活力的测定.pptVIP

实验七 淀粉酶活力的测定 一、实验目的 掌握测定淀粉酶活力的 原理 和 基本方法 二、实验原理 ? 酶是一种具有高度专一性的催化剂。其催化能 力的大小用 酶的活力 来表示。酶活力也称酶活 性，是以酶在 最适温度 、 最适 pH 等条件下，催 化一定的化学反应的 初速度 来表示。 本实验是以一定量的 α - 淀粉酶液，于 37 ℃ 、 pH6.8 的条件下，在一定的 初始作用时间 内将淀粉 转化为还原糖，然后通过与 DNS 试剂作用，比色 测定求得还原糖的生成量，从而计算出酶反应的 初速度，即酶的活力 这里规定，一个淀粉酶活力单位为在 37 ℃ 、 pH6.8 的条件下， 每分钟 水解淀粉生成 1 mg 还原 糖 所需要的 酶量 。 1 U=1 mg 还原糖 /min· mL 酶 三 . 实验材料及设备 1 、材料 淀粉酶液（ 粗酶液、盐析液、脱盐液 ） 2 、仪器 分光光度计 恒温水浴 沸水浴 3 、器材 刻度 试管： 25 mL × 17 移 液 管： 1 mL × 3 （取稀释后的酶液） 烧 杯： 250 mL × 1 滴 管： 2 洗 耳 球： 2 洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各 1 移 液 器：专取 NaOH 注 射 器：专取蛋白样品 四、试剂的配制 1 、淀粉溶液（ 0.5% ） 称取 5 g 可溶性淀粉，溶于 1000 mL 热水中。 2 、 3,5- 二硝基水杨酸试剂（ DNS 试剂） 3 、磷酸缓冲液（ 0.1 mol/L ， pH6.8 ）， 含 0.3% NaCl 4 、 NaOH 溶液（ 2.5mol/L ） 五 . 操作步骤 1 、淀粉酶的制备 （ 1 ）取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的粗 酶提取液解冻，取上清液 0.05 mL ，加蒸馏水稀释 到 25 mL ，摇匀备用 （ 2 ）取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的盐析 蛋白质解冻，取上清液 0.05 mL ，加蒸馏水稀释到 25 mL ，摇匀备用 （ 3 ）取葡聚糖凝胶层析脱盐获得的蛋白液解冻，取 0.05 mL ，稀释。 收集 1 管的同学，将 0.05 mL 稀释到 15 mL 收集 2 管的同学，将 0.05 mL 稀释到 10 mL 试管排列顺序 空白 F1 B3 B2 F3 ? F2 ? F1 ? B3 ? B2 ? B1 F3 F2 1 淀粉 3 2 B1 ? 粗酶液 盐 析 脱 盐 0 时刻 5 min 时刻 装约 20 mL 淀粉溶液， 标记，转至 37 ℃水浴 锅中 因淀粉中含有少量还原糖， 某些溶液有色素、杂质，需 查看酶不水解淀粉的情况 37 ℃ 室温 实验编号 操作 0 号管 粗酶液 (1) 盐析液 (2) 脱盐液 (3) 0 时刻 5min 时刻 0 时刻 5min 时刻 0 时刻 5min 时刻 B1 B1 F1 F1 B2 B2 F2 F2 B3 B3 F3 F3 淀粉酶液 (ml) 0.3 0.2 0.5 H 2 O (ml) 3.5 pH 6.8 缓冲液 各 1 ml 0.3 ％ NaCl 各 1 ml 预热 摇匀， 37 ℃ 水浴 2 min NaOH (ml) 1 1 1 1 1 1 预热的淀粉 各 1 ml ，迅速摇匀 酶促反应 37 ℃ 水浴 5 min ( 准确计时 ) NaOH (ml) 1 1 1 1 1 1 DNS 试剂 各 2 ml ，摇匀 显色反应 沸水浴 5 min ，冷却，各用水 定容至