细胞工程精华课件 七、细胞重组及动物克隆技术.pptVIP

第七章细胞重组及动物克隆技术 第一节　细胞重组技术 第二节　细胞核移植和动物克隆技术 概念与意义 发展概况 细胞重组及其技术关键 一、概念与意义 1. 细胞重组（又叫细胞拆合）（Cell Reconstruction）： 　　是指从活细胞中分离出细胞器及其组分，在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种实验技术。 2. 细胞重组过程： 细胞器及其分离→同种或异种细胞器与组分重组→新的重组细胞或新的性状或产品 细胞核分离、 细胞核 胞质体的获得 融合 胞质体 3. 细胞重组基本方式 4. 细胞重组意义 为重新构成不同类型的杂种细胞提供了可能； 结合基因转移技术人为地获得新物种，或使细胞表达新的性状和产生新的产物。 二、发展概况 ●细胞破碎方法 超声波破碎法 反复冻融法：-70o ~37oC，重复3-4次， 细胞壁破碎 化学裂解法：SDS（十二烷基磺酸钠） 高速组织捣碎法：需循环水冷却 ●细胞组分分离技术 分级分离法 细胞大小、密度 密度梯度离心法 利用 细胞表面电荷 流式细胞分选仪分离法 细胞表面标志 ●去核细胞（胞质体）的制备： ●核体的制备： 贴壁法纯化 核体需5-10h再贴壁 培养 分离 完整细胞只需2h （菲可液梯度离心） ●微核体的制备： CB具有排核作用，形成微核体； 0.1ug/mL秋水仙胺，48h，处理细胞→ 细胞微核化→离心14000r/min、20min，80-90%→1-3%牛血清密度梯度离心 2. 细胞重组技术关键 ●细胞器与完整细胞融合： ctDNA（叶绿体DNA） 　（抗药性、色素）　　　→细胞器分离→将细胞器包裹 mtDNA（线粒体DNA） 　　　　　　　　在脂质体或血影细胞→与完整细胞融合 ●生物大分子引入完整细胞： 　1975年，童第周、牛满江，鲤鱼或鲫鱼mRNA 鲤金鱼 金鱼受精卵 鲫金鱼 动物克隆技术 细胞核移植 动物克隆技术的意义及展望 克隆与无性繁殖： 无性繁殖：是指不经过雌雄两性生殖细胞的结合，只由一个生物体产生后代的生殖方式。 克隆：在动物上主要指通过核移植培育出遗传特征完全相同的新个体，在植物上进行的基因操作也称克隆。 　　因此，克隆是无性繁殖，但无性繁殖不一定是克隆。 动物克隆是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。发育早期的动物胚胎细胞，或成年动物的体细胞，经显微手术移植到去掉细胞核的卵母细胞中之后，在适当的条件下，可以重新发育成正常胚胎。这种胚胎被移植到生殖周期相近的母体之中，可以发育成为正常动物个体。经过核移植而产生的动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同。 这种不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克隆技术。 2. 理论基础： 　　体细胞具有细胞全能性 3. 发展历程： 2. 发展历程 ⑴ 两栖类细胞核移植 1938年Spemann最先提出将多细胞胚胎的每一个细胞核移植到去掉核的卵母细胞中，使它们重新发育成胚胎的设想。 1952年，Briggs和King沿用Spemann的思路和实验技术，首次获得两栖动物美洲豹蛙胚胎细胞核移植的后代。 核供体为囊胚期的胚胎细胞——实验成功 核供体为原肠胚期的中胚层和内胚层细胞——实验失败 ⑵ 鱼类的核移植　　　 　　从1961年开始，童第周等以金鱼和鳑鮍鱼为材料，进行鱼类不同亚科间的细胞核移植获得成功，用以研究杂交细胞核与纯种细胞核在发育功能上的差异，以及细胞质对细胞核的影响。 1979年，中国科学院武汉水生物研究所利用鲫鱼做移核试验。他们把鲫鱼囊胚期细胞经过385天59代连续传代培养后，再将此种培养细胞的细胞核移植到同种鲫鱼的未受精卵中。到1980年4月，他们成功地培育了两尾无性繁殖的幼鱼，其中一条发育正常。 　　1989年，童第周、牛满江又将鲫鱼胚胎细胞核移入鲤鱼去核的未受精卵中，实现了不同种间的核质杂交，成功地无性繁殖了“鲤鲫核鱼”新品种。