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重组天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定
赵雅嫱 黄妤璠 龙益如 王敏敏 白华山
1 原理
本实验主要是利用基因工程手段构建 L-天冬酰胺酶基因工程菌。
L-天冬酰胺酶的生理作用主要体现于其抗癌抗肿瘤活性,特别是对非
霍奇金淋巴瘤和 ALL 的有很强的抑制作用,目前适用于治疗黑色素
瘤、非何杰金病淋巴瘤等,也可以用于治疗急性单核细胞性白血病、慢
性淋巴细胞性白血病等。
目前,我国虽已投入生产 L-天冬酰胺酶,但是较国外生产成本高、
菌种产酶活性低,提取 化工艺落后。针对这些 问题,本实验对大肠
杆菌重组 L-天冬酰胺酶的制备、 化与鉴定进行了系统性的探究,意
图改进重组 L-天冬酰胺酶的表达,优化其 化工艺,分析其鉴定方法
与性质。
本实验主要进行了重组克隆载体和表达载体构建、表达与鉴定的
摸索;酶蛋白的诱导表达条件分析;酶蛋白分离 化手段的比较和选择,
如蔗糖溶液提取、硫酸铵分级沉淀、CM-Sephadex 和 DEAE-Sepharose
离子交换层析以及亲和层析;重组蛋白酶活力监控与本底蛋白活力测
定等等。
2 实验材料
实验仪器见表 1.1。型号和生产厂家根据实验室现有条件核定。
表 1.1 实验仪器或装置
仪器名称 型号 生产厂家
超净工作台
PCR 扩增仪
恒温培养箱
超低温冰箱
台式离心机
恒温摇床
涡轮振荡器
高压灭菌锅
蛋白电泳仪
核酸 电泳仪
凝胶成像仪
紫外分光光度
计
高效液相色谱
仪
扫描型紫外分
光光度计
制冰机
超声清洗机
实验试剂和材料见表 1.2。材质或规格以及来源根据实验需求以
及实验室现有条件核定。
表 1.2 试剂和材料
材质或
试剂或材料 来源
规格
CPU21
E.coli 野生型菌株 实验室储存
009
pMD18-T 50ng/μl 宝生物工程有限公司
pET-22b 50ng/μl 宝生物工程有限公司
Nde Ⅰ 10U/μl 宝生物工程有限公司
Xho Ⅰ 10U/μl 宝生物工程有限公司
350U/μ
T4 DNA Ligase 宝生物工程有限公司
l
离心柱 天根生化科技(北京)有限公
DNA 化试剂盒
型 司
Ni-NTA 树脂 化 离心柱
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