常见的生物化学与分子生物学实验.docVIP

一动物组织蛋白质的提取 【目的要求】1掌握动物组织蛋白质的提取方法。2了解动物组织蛋白质提取的原理。 【实验原理】由于蛋白质种类很多，性质上的差异很大，即或是同类蛋白质因选用材料不同使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质。蛋白质在不同溶剂中溶解度的差异主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用将细胞内蛋白质提取出来，并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些以可溶性的形式存在于体液如血浆、消化液等中可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。蛋白质经细胞破碎后用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物即得粗提取液。 【试剂器材】1实验小鼠20.9NaCl3动物组织蛋白裂解缓冲液Tris 50mM，NaC1150mM ，EDTA 0.5mM ，DTT 1mM ，Triton X-1001，去氧胆酸钠0.5，SDS 0.14，PMSF/异丙醇储备液100mM，174mg/10ml于-20℃储存5-20℃储存的冰块。 【操作步骤】1.颈椎脱白处死小鼠75酒精擦拭皮肤剪开腹部剪切肝脏组织称取0.6g置于含预冷0.9NaC16mL的平皿中。 2.在平皿中剪碎肝脏组织并转移到匀浆器中。 3.在预冷的裂解缓冲液中添加PMSF/异丙醇储备液20？L/2mL。 4.迅速将2mL预冷的裂解缓冲液加入匀浆器中冰浴条件下充分研磨。 5.将组织研磨液转移到1.5mL的离心管中于4℃离心14000rpml0min。2 6.离心完毕吸取上清液转移至一新的1.5ml离心管中即为组织蛋白粗提取液。 7.所获蛋白提取液可保存于-20℃用于后续实验或用考马斯亮蓝等方法进行蛋白质浓度测定后保存备用。 【注意事项】 在整个制备过程中使组织始终处于冰浴状态以防蛋白质的降解。 实验二蛋白质的定量Bradford法 【目的要求】掌握考马斯亮蓝Coomassie Brilliant Blue法测定蛋白质含量的原理和方法。 【实验原理】考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度是利用蛋白质与染料结合的原理定量测定微量蛋白质浓度具有快速、灵敏的特点。考马斯亮蓝G-250存在两种不同的颜色形式红色和蓝色。当染料与蛋白质结合后由红色转变成蓝色形式。蛋白质与G250的结合是通过范德华力实现的，并且在一定浓度范围内二者的结合显色符合朗伯-比尔定律。结合后的产物在595nm处具有最大吸收峰，通过对溶液的光吸收测定，可获得与其结合蛋白质的量。 【试剂器材】1.考马斯亮蓝试剂考马斯亮蓝G-250100mg溶于25mL甲醇中加入800mL蒸馏水再加入100mL85磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL滤纸过滤。2.标准蛋白质溶液1mg/mL牛血清白蛋白100mg加0.9NaCl至100mL。3.试管及试管架吸管。4.比色计。 【操作步骤】一、标准曲线的制备取5支试管编号按下表操作编号1号液、2号液、3号液、4号液、5号液、标准蛋白质溶液、0mL、0.20、40.60.81.01mg/mL、0.9NaClmL、0.80.60.40.2蛋白质浓度200、400、600、800、1000ug/mL。另取6支试管编号为05按下表操作编号012345，1号液2号液3号液4号液5号液不同浓度蛋白质溶液mL 0.10.10.10.10.1 0.9NaCImL0.1考马斯亮蓝试剂mL555555蛋白质含量ug0204060801003混匀各管室温下静置10分钟，于595nm处进行比色。 二、绘制标准曲线以A595nm为纵坐标，标准蛋白质含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 三、测定未知样品蛋白质浓度测定方法同上取适量未知样品使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值在标准曲线上查出其相当于标准蛋白质的量从而计算出未知样品的蛋白质浓度。 【注意事项】1在考马斯亮蓝试剂加入后的520分钟内测定光吸收因为在此段时间内颜色最稳定。2测定中蛋白一染料复合物会有少量吸附于比色杯壁上实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的测定后可用乙醇将比色杯洗干净。 实验三SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 【目的要求】1.了解并掌握SDS电泳原理及方法。2.掌握垂直板电泳