基因工程酶学基础精选.pptVIP

基因克隆的酶学基础 重组DNA实验中常用的若干种工具酶 粗略地可分为限制酶、连接酶、聚合酶和 修饰酶,以限制性内切酶和DNA连接酶的 作用最突出。 栋酸酶名称 11 在特异性的碱基序列部位切割DNA分子 DNA连接酶 将两条DNA分子或片段连接成一个整体 大晒杆菌DNA聚合酶I 通过向3端逐一增加核苷酸的方式填补双链DNA分了上的 反转录 以RNA分子为模板合成互补的cDNA链 核苷酸激酶 把一个酸分子加到多核苷酸链的5OH末端 同聚物尾巴加到线性双链DNA分子或单链DNA分子的3 核酸外切酶III 从一条DNA链的3-移去核苷酸残基 λ核酸外切降 化自双链DNA分子的5·剩移走单核待酸从而暴露出延伸的 单链8-端 催化从DNA分子的5′-或3-端或同时从5-和3-端移去来端 核 催化RNA和单DNA分了阵解成5单核苷酸,同时也可切割双 链核酸分子的单链区 hal31核酸酶 具有单链特异的核酸内切酶活性,也具有程链特异的核酸外切酶 aDNA台荫 能在高温(72C)F以单链DNA为模板s→3方向合成断生罩 31限制性内切酶与DNA分子的体外切割 1限制性内切酶的类型 能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列(4 6bp),并在此处切割DNA双链的核酸内切酶 主要从原核生物分离纯化出来,是原核生物自我保 护的机制(限制和修饰系统)。限制指细菌可通过 限制性内切酶的切割作用,破坏入侵的噬菌体DNA, 导致噬菌体的寄主范围受到限制。修饰作用指寄主 菌本身的DNA,在合成后就被自身的甲基化酶甲基 化,使自身DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶 的破坏。哺乳动物没有限制修饰系统 ■按酶蛋白的组成和裂解DNA的方式分为Ⅰ、∏、II三类。 Ⅲ型 (1)限制和修饰活性 一多功能的酶 分开的核酸内切酶和甲基具有一种共阿亚基的双 2)核酸内切限制酶的蛋白质3种不同的亚基 2种不同的亚基 (3)限制作用所需的辅助因子 IPMg,S廉昔甲硫Mg2+ ATP、Mg2、(s腺苷 甲硫酸) (4)寄主特异性位点序列 EcoBITGAON) RTGCT旋转对称s型例外) EcoPlIAGACC Ec。P15: CAGCAG (5)切割位点 在距寄主特异性位点至位于寄主特异性位点或其距寄主特异性位点3端 少1000bp的地方可能对近 随机地切割 6)酶转换 (7)DNA易位作用 不能 (8)甲基化作用的位点 寄主特异性的位 寄主特异性的位点 寄主特异性的位点 (9)识别未甲基化的序列进行能 核酸内切酶切割 1D)序列特异的切割 (11)在DNA克隆中的用处 分有用 用处不大 312II型限制性内切酶的基本特性 H O Smith和KW. Wilcox1970年在流感噬血菌Rd菌株 中分离处 HIndl。 识别特异的未甲基化修饰DNA序列,长度4-8个核苷酸 识别序列多呈180度旋转对称(回文结构) 少数可识别2种以上核苷酸序列; 作用形成的DNA断裂切口有2种类型: 粘性末端和平末端 粘性末端:断裂位置交错,对称围绕在中心轴,5′端 突出或3·端突出 平末端:断裂位置在中轴上