RNA提取注意事项.pdf

精品文档 RNA提取心得 / 经验 / 体会 / 纪律（ RNA提取注意事项） ！ 纪律一：杜绝外源酶的污染。 注意一：操作环境干净无灰尘，严格戴好口罩，手套。 注意二：实验所涉及的离心管， Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要 彻底处理。 注意三：实验所涉及的试剂 / 溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free 。 纪律二：阻止内源酶的活性 注意四：选择合适的匀浆方法。 注意五：选择合适的裂解液。 注意六：控制好样品的起始量。 纪律三：明确自己的抽提目的 注意七：任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。 注意八： RNA抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得 率。 Rnase 污染的 10 大来源 1：手指头 – 手指头是外源酶的第一来源，所以必需戴手套并且频繁更换。另 外，口罩也必需戴， 因为呼吸也是一个重要的酶来源。 戴手套口罩的另外的好处 是保护实验人员。 2 ：枪头，离心管，移液器 – 单纯的灭菌是不能灭活 Rnase 的，所以枪头和离 心管要用 DEPC 处理， 即使是标明为 DEPC 处理过的。移液器最好是专用的， 用 前用 75% 的酒精棉球搽拭干净，尤其是杆子；另外，一定不要使用褪头器。 3：水/ 缓冲液 – 一定要确保无 Rnase 污染。 4 ：实验台面 – 最起码要用 75% 的酒精棉球搽拭干净。 5：内源 Rnase – 所有组织均含内源酶，故组织用液氮速冻是降低降解的最好 办法。液氮保存 / 碾磨方法的确不方便，但对有一些内源酶含量很高的组织，却 是唯一的办法。 6：RNA样品 – RNA 抽提产物可能都会含痕量的 Rnase 污染。 7：质粒抽提 – 质粒抽提往往用到 Rnase 降解 RNA，残留的 Rnase 要用 Proteinase K 消化， PCI 抽提。 8：RNA保存 – 即使低温保存，痕量的 Rnase 亦会导致 RNA 降解。长期保存 RNA 的最好办法是盐 / 醇悬液，因为醇在低温时抑制所有的酶活性。 9：阳离子 (Ca, Mg) – 在含这些离子时， 80C 加热 5 分钟会导致 RNA 被剪切， 故如果 RNA 需要被加热，保存液需要含螯合剂 (1mM Sodium Citrate, pH6.4) 。 10：后续实验所用的酶 – 酶均有可能被 Rnase 污染。 RNase 和 DEPC 处理 1：高压灭菌是可以灭活部分 Rnase A 的。实验证明： 37 C 与 RNA 反应，没有 灭菌的 PBS，活性点为 100 pg/ml ；灭菌后，活性点为 100 ng/ml 。当然，灭菌 后 Rnase 仍然不能认为没有残留。 。 1欢迎下载 精品文档 2 ：DEPC在水中半衰期为 30 分钟。 0.1% 的 DEPC 灭菌 15 分钟可以认为彻底 破坏了 DEPC。破坏后可以闻到一点气味。 3：在 1MTris, 1MHEPES,1MMOPS中分别加入 1ug/ml RnaseA 和 0.1% 及 1% DEPC实验。结果提示， 0.1% DEPC只对 MOPS有效，而 1% DEPC对三种试剂都 有效。 4 ：0.01% DEPC，0.1% DEPC，1% DEPC有效去除 Rnase A 的浓度分别为： 100 ng