中性粒细胞分离实验步骤.docVIP

一、中性粒细胞初步分选 试剂与耗材：人淋巴细胞分离液、RP1640、15ml离心管4支，棉球，止血带、碘伏、采血针，5mlEDTA抗凝采血管2支。1ml 枪及枪头。 分离步骤： 所有试剂恢复至室温； EDTA抗凝采血管收集人外周血10ml; 分别将5ml外周血加入5ml人淋巴细胞分离液中（15ml离心管中进行）；注意动作轻柔缓缓加入； 500g离心，30-35分钟，室温； 离心后收集低带中性粒细胞，分两层，第一层为单核细胞，第二层为中性粒细胞；（若离心后分层不明显则多离心5-10分钟） 将RP1640用纯水稀释为50%RP1640用于重悬中性粒细胞，恢复细胞活性。（5-10分钟） 400g离心10分钟，去上清，收集中性粒细胞，重悬于RP1640中，细胞计数。 二、中性粒细胞磁珠分选 试剂耗材及设备：磁力分选器，磁柱，CD15磁珠试剂盒，磁珠分选缓冲液50ml，RP1640，1ml 枪及枪头，20微升枪与枪头，15ml离心管4支，细胞计数板。 步骤： 制冰，保证磁力分选器可以放入冰盒内操作，在4-8℃ 配液磁珠分选缓冲液（50ml PBS液中含2mmol/L EDTA，0.5%BSA，PH=7.2）； 将上步初步分选的中性粒细胞悬液300g离心10分钟，去上清； 细胞重悬于磁珠分选缓冲液中，107细胞重悬于80微升缓冲液中；（如细胞数多