实验8 考马斯亮蓝染色显示细胞骨架共16页.ppt

2019/9/20 1 实验 8 考马斯亮蓝染色显示细胞骨架 1 、了解细胞骨架成分显示方法的原理和操作步骤； 2 、观察微丝在细胞中的分布。 一、实验目的 2019/9/20 2 ? 细胞骨架的概念为真核细胞胞质中的蛋白质构成的纤 维系统，在细胞的形态维持、细胞的运动、物质运输 和细胞分裂中发挥重要作用。三种组成成分： 微丝、 微管、 中等纤维 ? 非肌细胞中的微丝是动态结构，肌动蛋白单体（ G- actin ）与纤维（ F-actin ）在一定条件下互相转化。 本实验中 M- 缓冲液提供的离子条件可使 F-actin 稳定。 二、实验原理 2019/9/20 3 中等纤维 微管 微丝 2019/9/20 4 二、实验原理 ? 考马斯亮蓝 R250(Coomassie blue R250) 是一种蛋白质染 料，不能特异地显示细胞骨架蛋白。用含非离子型去垢剂 TritonX-100 的缓冲液处理细胞，可将细胞的膜结构和部分 蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白质却被保留，用考 马斯亮蓝 R 250 染色后，在光学显微镜下可见一种网状结构， 其主要成分为直径 40nm 左右的微丝束。 ? 观察时可能会发现细胞膜上有些孔洞，甚至有些细胞变 空了，这可能是由于 Triton X-100 处理时间过久破坏细胞 结构所致。 2019/9/20 5 培养的成纤维细胞用 Coomassie blue 染色的结果 2019/9/20 6 显示细胞骨架成分的特异性方法 1 、特异性的药物结合反应： 如罗丹明标记的鬼笔环肽，可以显示微丝 2 、免疫细胞化学方法： 制备细胞骨架蛋白的特异性抗体，用免疫 荧光、免疫酶标的方法显示细胞骨架 2019/9/20 7 免疫荧光染色 左：微丝，中：微管 ，右：中等纤维 2019/9/20 8 三、实验用品 复式显微镜（带油浸物镜） 擦镜纸（ lens paper ）；记号笔；小片滤纸；载 玻片；盖玻片；剪刀；镊子；洋葱鳞茎 ① 1% TritonX-100 ； ② M 缓冲液； ③ 3% 戊二醛； ④ pH6.8 磷酸缓冲液； ⑤ 0.2% 考马斯亮蓝 R-250 染色液 2019/9/20 9 四、实验步骤 1 ．用镊子撕取洋葱鳞茎内侧的表皮，剪成约 1cm 见方。 置于 pH6.8 的磷酸缓冲液中，使其下沉 （ 每人做 2 片， 不要太大，否则不易展开） 。 2 ．吸弃磷酸缓冲液，用 1% TritonX-100 处理 20 mins 。 对照组使用 M 缓冲液处理。 3 ． M 缓冲液洗 5 mins X 3 times 4 ． 3% 戊二醛固定 30 min （或 Carnoy 固定液） 5 ．磷酸缓冲液洗 5 mins X 3 times 。 6 ． 0.2% 考马斯亮蓝染色 30 mins ，蒸馏水冲液洗一次， 5 分钟。然后将表皮（带少量液体）平铺在载玻片上， 加盖玻片，显微镜下观察。 2019/9/20 10 ? 洋葱表皮细胞（ 200 倍） 五、实验结果 2019/9/20 11 ? 洋葱表皮细胞（ 400 倍） 五、实验结果 2019/9/20 12 ? 洋葱表皮细胞（对照组， 100 倍） 五、实验结果 2019/9/20 13 五、实验结果