实验二 细菌的革兰氏染色及芽孢染色法.ppt

实验二 细菌的革兰氏染色及 芽孢染色法 实验一存在问题 ? 1 、 香柏油要加适量 ? 2 、涂完菌后接种环一定要灼烧灭菌 ? 3 、无菌操作 ? 4 、擦镜纸浪费 ? 5 、载玻片要洗干净 ? 6 、画图不符合要求 细菌 个体 微小 半透 明 未 染色 细菌 大致 形态 大小 单染色法 复染色法 能看清形态大小 但是无鉴别意义 能看清形态大小 又有鉴别意义 显微镜 细菌的染色 （一）实验目的： ? 1 、学习并掌握革兰氏染色法和芽孢染色法。 ? 2 、巩固显微镜油镜的使用技术和无菌操作技术。 ? 革兰氏染色法 ： 是 1884 年由丹麦病理学家所创立的。革 兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌 （ G + ） 和 革兰氏阴性菌 （ G — ） 两大类，该染色法所以能将细菌分 为 G + 菌和 G — 菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同 所决定的。 （二）实验原理——革兰氏染色原理 革兰阳性菌细胞壁的化学组成 肽聚糖（ 15-50 层） 细胞膜（双层脂质 蛋白嵌镶） 脂质 蛋白质 β -1,4 糖苷键 N- 乙酰葡萄糖胺 N- 乙酰胞壁酸 四肽链 五肽桥 革兰阴性菌细胞壁的化学组成 外膜 肽聚糖（ 1-3 层） 细胞膜 脂质 蛋白质 脂质双层 脂蛋白 脂多糖 ? G + 菌细胞壁较厚，肽聚糖含量较 高，网格结构紧密，含脂量低， 当被酒精脱色时，引起了细胞壁 肽聚糖层网状结构的孔径缩小以 至关闭，从而阻止了不溶性结晶 紫 - 碘复合物的逸出，还是原来 的颜色。 ? G ˉ 肽聚糖层较薄，交联度低， 含较多类脂质，故用乙醇处理后， 类脂质被溶解，细胞壁孔径变大， 通透性增加，使初染的结晶紫和 碘的复合物易于渗出，细胞被脱 色，经沙黄复染呈红色。 结晶紫初染 碘液媒染 乙醇脱色 番红复染 涂片固定 （二）实验原理 —— 革兰氏染色原理 芽孢（内生孢子）及其研究芽孢的重要性 ? 芽孢是某些 G + 菌形成的圆形或椭圆形的休眠体，抗热性 和折光性较强。 ? 芽孢的大小、形态、位置可做分类依据。 （二）实验原理 —— 芽孢染色法原理 中央芽孢 偏端芽孢 游离芽孢 末端芽孢 （二）实验原理 —— 芽孢染色法原理 ? 芽孢壁厚、透性低，着色和脱色均较困难； ? 但当用弱碱性染料（孔雀绿）在加热的情况下进行 染色时，染料可进入菌体和芽孢； ? 进入菌体的染料经水洗后可被脱色； ? 当用对比度大、浅色的复染色剂（番红）染色后， 芽孢仍保留初染剂的颜色（绿色），而菌体呈复染 剂颜色（红色）。 1 、活材料： ? 革兰氏染色：培养 12h-16h 枯草杆菌（ Bacillus subtilis ） 和培养 24h 大肠杆菌（ Escherichia coli ） ? 芽孢染色：培养 28-36 小时 的蜡状芽孢杆菌（ Bacillus thuringiensis ） 2 、染色液和试剂： ? 革兰氏染色染色液：结晶紫、卢哥氏碘液、 95% 酒精、蕃 红； ? 芽孢染色液： 5% 孔雀绿水溶液、 0.5% 蕃红水溶液 ； ? 二甲苯、香柏油 。 3 、 器材： ? 载玻片、接种杯、木夹子、酒精灯、擦镜纸、显微镜。 （三）实验器材 1. 细菌涂片标本的制作 （ 1 ）涂片 载玻片 1 张，加 1 滴生理盐水，取菌研磨均匀。 （ 2 ）干燥 室温干燥，或置酒精灯高处慢慢烘烤。 （ 3 ）固定 干燥后的涂片，在酒精灯火焰中通过 3 次。 （四）实验步骤 —— 革兰氏染色 2. 革兰法染色 （ 1 ）初染 结 晶 紫 2min 细水冲洗 甩去积水 （ 2 ）媒染 卢戈碘液 1min 细水冲洗 甩去积水 （ 3 ）脱色 95% 乙醇 20-30s 细水冲洗 甩去积水 （ 4 ）复染 番红 3min 细水冲洗 甩去积水 （四）实验步骤 —— 革兰氏染色 3. 观察实验结果 待标本自干或用吸水纸吸干后，置显微 镜下检查。 革兰阳性菌（ G + ）， 被染成 蓝紫 色。 革兰阴性菌（ G - ）， 被染成 红 色 。 （四）实验步骤 —— 革兰氏染色 实验程序Ⅰ （革兰氏染色的方法和步骤） 涂片 蒸 馏 水 涂 片 结 晶 紫 碘 液 95% 乙醇 自然干燥 媒染 1min 脱色 20~30s 初染 1min 、 后水 洗 固定 番 红 复染 2min 干燥 镜检 水洗时不要直接冲菌膜 水洗 水洗 水洗 每人取大肠杆菌和枯草杆菌，做一块混合涂片，进行革兰氏染色。 2 分钟 1 分钟 3 分钟 干 燥 固 定 取一干净载玻片→→在两端各加一滴生理盐水→→无 菌操作取菌种→→涂于生理盐水中（ 成菌膜 ） →→ 自然干燥→→火焰固定→→ 初染 （ 结晶紫， 2min ） →→水洗→→ 媒染 （ 碘液， 1min ） →→水洗→→ 脱 色 （ 乙