血凝及血凝抑制试验.ppt

实验二 血凝及血凝抑制实验 实验目的 １血凝试验：滴定病毒的血凝效价 ( 病毒的凝集价 ) ， 采用一定的病毒量，通常采用 4 个血凝单位。 ２血凝抑制试验： 应用标准病毒液测定血清中的相应抗体或应用特 异性抗体鉴定新分离的血凝性病毒． ３检测实验用鸡群有无病毒感染和监测鸡的免疫状 态。 ４ 掌握基本操作技术 , 了解其实用价值 ． 实验原理 血凝素（ HA ） 柱状 流感病毒结构模式图 刺突：亚型特异性抗原，易变异 血凝素（ HA ，从 H1 — H15): 呈柱状 功能： ①吸附细胞：与细胞上受体结合 , 使病毒 侵入细胞 ②凝集多种动物的红细胞（血凝试验） ③具抗原性：其抗体能中和病毒 --- 中和抗体 抑制血凝（血凝抑制试验） 血凝试验原理 ? 血凝素（ hemagglutinin HA ）：由病毒基因 编码的糖蛋白刺突。 ? 与病毒吸附和传入宿主细胞有关。 ? HA 能与人或其它动物多种红细胞表面 N － 乙酰神经氨酸酶受体结合引起红细胞凝集。 ? 为病毒的 红细胞凝集反应或血凝反应。 血凝原理 血凝抑制原理 血凝抑制试验原理 病毒引起的血凝现象能被相应的抗血凝素抗体所 抑制，即抗体与病毒结合后，血凝素无法吸附于 红细胞表面的受体上，用免疫血清阻止红细胞凝 集的现象，称为 血凝抑制 ． 实验材料 器材： U 型或 V 型微量反应板、微量移液器、枪头 试剂： 1% 鸡红细胞、 NDIV 血凝素、 NDIV 抗血清、生 理盐水 实验步骤 1. 取 96 孔 V 型反应板 1 块置于水平实验台上，在第 1 排 1-10 孔内加入 25ul 生理盐水，第 11 孔不加。第 12 孔加 25ul 生理盐水 2. 在第 1 孔内加入血凝素 25ul ，混匀后吸出 25ul 加入第 2 孔内，再混匀后吸出 25ul 加入第 3 孔内，依次类推至 第 10 孔时弃掉 25ul 。第 12 孔不加作阴性对照孔。 ? 3. 在 1-12 孔均加入 25ul 的生理盐水。 ? 4. 在每孔内加入 25ul1% 的鸡红细胞悬液，震荡， 室温静止感作 15-30min ，每 5min 观察一次结果。 ? 5. 计算血凝效价，稀释使成为四价备用． 血凝试验结果判定 ? 效价判定： 凝集特别显著：“＋＋＋＋” 凝集现象次之：“＋＋＋” 凝集清楚可见：“＋＋” 稍显凝集者：“＋” ? 血凝效价：呈“＋＋”凝集时的最高稀释 度。此时的稀释度即为 1 个血凝单位。 结果判定 1. 在各组对照均正确的情况下，按下列标准判定 血凝反应强度示意图 “ 4 ＋” 红细胞呈片状凝集，均匀布满孔底，边缘有时不整齐或皱 缩。 “ 3 ＋” 红细胞呈片状凝集，但面积略小于“ 4 +” 。 “ 2 ＋” 红细胞呈片状凝集，但有少许沉积孔底中部呈小圆点状。 “＋” 红细胞大部分沉于孔底中央，周围有少量散在凝集颗粒。 “－” 红细胞均沉于孔底呈小圆点状，边缘整齐。 2. 对照孔正常的情况下，红细胞凝集 100% 的稀释度为判定血凝价的 终点。凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数为病毒的凝集 价。 血凝抑制 1 . 取 96 孔 V 型反应板 1 块置于水平实验台上，在第 1 排 1- 10 孔内加入 25ul 生理盐水，第 11 孔不加。第 12 孔加 25ul 生理盐水。 2. 在第 1 孔内加入被检血清 25ul ，混匀后吸出 25ul 加入 第 2 孔内，再混匀后吸出 25ul 加入第 3 孔内，依次类推至 第 10 孔时弃掉 25ul 。第 12 孔不加作阴性对照孔。 ? 3. 在 1-12 孔内均加入“四价”血凝素 25ul ，震荡 后，室温静止作用 5min 。 ? 4. 在 1-12 孔内均加入 1% 的鸡红细胞悬液 25ul ，震 荡，室温感作 15-30min ，每 5min 观察一次结果。 ? 5. 观测结果，记录实验数据 ． 血凝抑制试验结果判定 ? 测定孔 RBC 沉于孔底中心，呈纽扣状。 (+) 凝集 （ - ）