荧光原位杂交试验.ppt

一、实验目的 ? 通过实验了解荧光原位杂交技术的基本 原理和在生物学、医学领域的应用。 ? 掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌 握荧光显微镜的使用方法。 二、实验原理 ? FISH 的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按 照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进 行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于 DNA 分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列， 因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的 基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交 相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特 异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传 学领域受到普遍关注。目前这项技术已经广泛应用于 动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、 病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组 进化研究等许多领域。 三、实验用具及材料 ? Y 染色体探针、人外周血中期染色体细胞 标本、恒温水浴锅、培养箱、染色缸、 载玻片、 Nikon E-400 、荧光显微镜、盖 玻片、封口膜、 200 μ L 移液器、 20 μ L 移 液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化钠、 柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温 20 。 四、实验方法及步骤 1. 探针及标本的变性 ? 探针变性： ? 标本变性 ： 2. 杂交 ? DNA 探针 10 μ L 滴于已变性并脱水的玻片标 本上，盖上 18 × 18 盖玻片，用 Parafilm 封片，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜 （约 15 ～ 17h ）。 3. 洗脱 4. 杂交信号的放大 5. 封片 ? 可采用不同类型的封片液。如果封片液 中不含有 Mowiol （可使封片液产生自封 闭作用），为防止盖片与载片之间的溶 液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。 封好的玻片标本可以在 -20 ～ -70 的冰箱 中的暗盒中保持数月之久。 6. 荧光显微镜观察 FISH 结果 ? 先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野， 然后打开荧光激发光源， FITC 的激发波长为 490nm 。细胞被 PI 染成红色，而经 FITC 标记 的探针所在的位置发出绿色荧光。 ? 本实验使用的是 Y 染色体上的特异序列，因 此在男性外周血染色体标本的杂交中呈阳性， 即使在未分裂的细胞中，也可以观察到明显 的杂交信号。照相记录实验结果。 观察结果 ? (a) 间期细 胞 ? (b) 中期细 胞， Y 染色 体荧光标记 探针 五、作业及思考题 ? 1. 通过实验总结荧光原位杂交实验的技 术关键。 ? 2. 实验中会不会出现假阳性，为什么？